去泛素化酶在病毒感染中的调控作用①

夏思墨 刘 翔 杨正东 徐 胜

(海军军医大学医学免疫学国家重点实验室,上海200433)

病毒感染后，机体的抗病毒炎性信号通路在体内需受到精密调控，既不能太弱以致不能有效清除病原体，也不能过强以免造成免疫损伤。蛋白的翻译后修饰(如磷酸化、糖基化、泛素化、类泛素化等)在炎症信号中发挥重要的调控功能。泛素化修饰是其中重要的一种，病毒感染后宿主信号分子蛋白的泛素化修饰决定了信号通路的启动、强弱及终止。泛素化-去泛素化是一个动态过程，去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)作为蛋白泛素化的负向调控分子，在病毒感染中发挥重要调控功能。在本文中，我们对宿主本身去泛素化酶及病毒编码的去泛素化酶在病毒感染过程中的调控作用做简要综述。

1 去泛素化酶

大多数蛋白质进行的泛素化是泛素蛋白与其底物蛋白结合的过程[1]。泛素是由76个氨基酸残基组成的保守小分子多肽。泛素首先由E1泛素激活酶激活，随后在E2泛素结合酶和E3泛素连接酶介导下，将泛素转移至底物内部赖氨酸残基[2]。在真核细胞中，存在数百种不同的E3泛素连接酶，这些酶决定了泛素化修饰的特异性，在蛋白的翻译后修饰中起到关键作用[3]。研究表明，泛素化参与了免疫应答、炎症反应、细胞周期、细胞连接、细胞凋亡、DNA修复、蛋白质降解和肿瘤的发展进程等许多重要的生物学过程[1,2,4]。泛素化修饰一般为多聚泛素化，泛素自身有7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，任何一个都可以和另一个泛素相连接，形成不同的多聚泛素链，在信号传导通路中发挥不同的作用[5,6]。例如K11、K27、K33和K63的多聚泛素化可以保护蛋白质免于降解，其中K63多聚泛素化还能影响细胞功能，如内吞、DNA修复和信号通路激活，而K48的多聚泛素化调控靶蛋白的蛋白酶体-依赖性降解[6-8]。

蛋白质的泛素化修饰可以通过细胞的DUBs去除，DUBs通过水解多聚泛素链，从而逆转泛素化，在泛素介导的信号通路发挥着重要调控作用[9,10]。人类基因组编码的DUBs是一个庞大的家族,在人类的细胞中有一百多种，分为六个不同的DUBs亚家族，其中包括五个半胱氨酸家族：泛素特异性蛋白酶家族(USPs)、卵巢肿瘤蛋白酶家族(OTUs)、泛素C-末端水解酶家族(UCHs)、Josephin家族和MINDY家族，此外，还有JAB1/MPN/MOV34金属酶家族(JAMMs，也被称为MPN+和以下简称JAMM/MPN+)[11]。

USPs家族是去泛素化酶家族成员最多，且结构最富有多样性。目前已经发现有五十多种，都含有USP结构域，它的催化结构域序列中含有Cys-His-Asp三联残基组成的活性位点，能将泛素分子从大的蛋白上移除。OTUs家族都含有OTU结构域，在Cys和His催化残基周围存在保守序列，与其他的半胱氨酸蛋白酶不同，它的催化三联体是不完整的，并且通过氢键固定。UCHs是第一个被发现的去泛素化酶家族，但是对于它们的特异性功能仍然了解较少。它们含有UCH结构域，能够切割相对较短的泛素化蛋白底物，大概20～30个氨基酸，这一特点可能与其活性位点的环状结构限制有关。MINDY的去泛素化酶在整个真核生物中高度保守，含有MIU结构域，并且特异性切割K48连接泛素链[11-13]。JAMM/MPN+家族是锌依赖的金属蛋白酶，含有JAMM结构域。JAMM结构域与胞苷脱氢酶相似，说明这个家族与进化有关。去泛素化酶参与众多细胞生物学过程，如细胞周期、蛋白降解、基因表达等。

2 去泛素化酶调控机体抗病毒天然免疫反应

体内有多种病毒传感器，如胞浆传感器(MDA5、RIG-Ⅰ、DAI、cGAS、IFI16)和体内传感器(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)。这些传感器识别病毒的核酸后，通过K27和K63泛素信号分子并激活下游信号通路。而K48泛素化则促进信号分子降解，抑制抗病毒信号通路。RIG-Ⅰ/MAVS信号通路在RNA病毒天然免疫中发挥重要作用，RIG-Ⅰ的K63连接多聚泛素化在抗病毒免疫反应启动中是必不可少的。USP21一方面通过结合RIG-Ⅰ的CARD结构域，去除K63连接泛素化，抑制TRIM25和RNF135介导的RIG-Ⅰ多聚泛素化，抑制RIG-Ⅰ诱导的IRF3的激活和IFN-β产生，进而抑制抗病毒免疫应答[14,15]。USP4在病毒诱导的RIG-Ⅰ活化后其表达减弱，USP4通过去泛素化K48连接的泛素链，稳定RIG-Ⅰ而起作用，进而产生抗病毒免疫反应。当USP4过度表达时，RIG-Ⅰ蛋白表达和RIG-Ⅰ诱导的IFN-β显著增强，并且同时抑制水泡性口炎病毒(VSV)复制[16]。USP3和 USP15也都通过靶向RIG-Ⅰ，去除K63多聚泛素链，抑制RIG-Ⅰ/MAVS信号通路诱导的IFN的产生[17,18]。

除了靶向病毒受体，去泛素化酶也可以作用于病毒受体下游信号通路。Beclin-1在自噬的发生发展中起着重要的作用。USP19通过去除Beclin-1上K11连接的泛素链来稳定Beclin-1，促进细胞内自噬，并以依赖Beclin-1的方式抑制RIG-Ⅰ/MAVS相互作用，从而抑制TBK1/IRF3的活化和IFN的产生[19]。 USP25在DNA或RNA病毒感染时，保护病毒诱导的TRAF3和TRAF6免受降解，增强Ⅰ型IFN和促炎性细胞因子的产生，发挥抗病毒天然免疫反应，但具体去泛素化位点尚不明确。USP25缺陷型小鼠更容易感染H5N1和HSV-1[20]。TBK1在激活天然免疫反应和免疫稳态的维持中起重要作用，USP1和其相关因子UAF1形成去泛素化酶复合物作为病毒感染诱导的TBK1表达的生理增强剂，通过与TBK1结合，去除TBK1的K48连接多聚泛素链，逆转TBK1的降解，促进IFN-β的表达并抑制病毒复制[21]。CYLD也可以通过靶向TBK1，使其去泛素化，抑制TBK1诱导的IRF3反应和IFN的产生，但是去除TBK1的泛素化位点尚不明确[22,23]。STING是抗DNA病毒天然免疫反应必要的衔接蛋白，STING的激活需要通过E3连接酶介导K27或K63的泛素化[24]。USP13通过作用于STING的K27泛素链，使STING去泛素化，负向调控IRF3的激活，抑制Ⅰ型IFN和炎性细胞因子的产生[25]。

TLRs在病毒识别及机体抗病毒免疫中也发挥重要作用。TLRs的TLR3、TLR7和TLR8识别病毒的ssRNA，诱导抗病毒免疫反应通过Ⅰ型IFN和炎症细胞因子的产生； TLR9识别细菌和病毒中的非甲基化2′-脱氧核糖(胞苷-磷酸鸟苷)(CpG)DNA基序，合成CpG的寡脱氧核苷酸的TLR9配体直接激活树突状细胞、巨噬细胞[26,27]。USP2a与TRAF6组成性结合，并且除去TRAF6的K63连接的多聚泛素蛋白链，进而负向调控Toll样受体诱导的NF-κB活化[28]。A20具有终止TLR信号传导导致NF-κB活化所需的去泛素化酶活性。A20的N-端和去泛素化酶的活性能够抑制LMP1(EBV癌蛋白)刺激诱导的IRF7的泛素化，负向调节LMP1介导的病毒潜伏期[29]。

3 病毒编码的去泛素化酶在病毒感染免疫中的调控作用

宿主的抗病毒免疫信号通路受到泛素化-去泛素化修饰的调控，病毒也通过利用宿主的泛素系统，以利于其入侵、免疫逃逸、出芽等过程[30]。具有编码去泛素化酶的病毒能够模拟宿主的DUBs，积极地破坏细胞泛素依赖性过程，抑制先天性抗病毒免疫反应，进而促进病毒复制[9]。病毒与宿主共同进化，以获得类似的机制来欺骗免疫系统，并建立感染[31]。

Kattenhorn等[32]首次在病毒复制间期的单纯疱疹病毒(HSV-1)中，发现UL36基因产物是一种具有去泛素化活性的泛素特异性半胱氨酸蛋白酶。增殖细胞核抗原(PCNA)通过结合HSV-1病毒合成的蛋白，抑制病毒DNA的复制。在HSV-1感染的细胞中，UL36通过促进其底物PCNA去泛素化，促进HSV-1病毒的复制[33]。EBV是一种人类致癌疱疹病毒，EBV 编码的BPLF1蛋白通过去泛素化TRAF6以抑制NF-κB信号转导，促进病毒的DNA复制[34]。卡波西肉瘤相关疱疹病毒[KSHV/人疱疹病毒8(HHV-8)]也属于EBV，其编码的具有去泛素化酶活性的皮层蛋白ORF64通过减少RIG-Ⅰ的泛素化，抑制 RIG-Ⅰ介导的IFN产生并促进KSHV的复制，但具体作用位点尚不明确[35]。此外HCMV病毒编码的pUL48能够去泛素化TRAF3[36]、HBV病毒编码的HBx使RIG-Ⅰ和TRAF3的K63连接多聚泛素链去泛素化[37,38]，均能抑制Ⅰ型IFN的合成。但仍然有些病毒编码的去泛素化酶的作用靶点尚未发现，如MHV68编码的ORF64[31]，还需要我们进一步研究。

4 去泛素化酶对病毒诱导细胞凋亡的调控

细胞凋亡是一种高度调节的细胞死亡类型，参与几乎所有疾病(包括病毒感染和肿瘤等)。对于病毒来说，有效抑制宿主细胞死亡可以有助于其成功存活或潜伏。病毒感染的细胞凋亡可能会阻止宿主中一些病毒的扩增和传播，因此，病毒诱导的细胞凋亡是一种保护宿主的防御机制[39]。

人类疱疹病毒6(HHV-6)感染的各种细胞系中，p53的泛素化大大减少，稳定性增强，使p53蛋白水平增加，抑制了被感染的细胞凋亡[40]。机制研究表明，HHV-6编码蛋白HAUSP不仅能够稳定p53抑制细胞凋亡，还能诱导p53依赖的细胞增殖，促进病毒扩散[41]。乙型肝炎病毒(HBV)感染造成肝细胞死亡和肝损伤，最终导致肝硬化和肝癌。HBV的X蛋白(HBx)通过调控肝细胞中miR-125a上调，进而抑制A20的表达，抑制了caspase8上K63连接的多聚泛素化，促进caspase8的活化，进一步促进了HBx介导的细胞凋亡[42]。USP10通过招募应激颗粒，减少ROS的产生并抑制ROS依赖的细胞凋亡。人类Ⅰ型T细胞白血病病毒的癌蛋白TAX能与USP10相互作用，削弱USP10的作用，抑制砷诱导应激颗粒的形成，刺激ROS的产生，增加了在HTLV-1感染的T细胞中ROS依赖的细胞凋亡[43]。精确检测去泛素化酶是如何参与由病毒引起细胞凋亡和肿瘤的发生，能极大地补充我们对DUBs功能的理解，并且有助于我们开发用于治疗病毒相关疾病的新疗法[44]。

5 DUBs在病毒感染性疾病治疗中的应用

目前已经有多种去泛素化酶抑制剂，如b-AP15通过抑制UCH15和USP14抑制人类肿瘤的发展和小鼠的乳腺癌、肺癌、结肠癌等。Azepan-4-ones抑制UCH15和USP14、WPI 130抑制UCH家族、6-Amino-pyrimidines抑制USP1等去泛素化酶抑制剂，具有抗肿瘤作用。Tricyclic heterocyclics通过抑制USP14用于治疗神经性疾病和抑制肿瘤的发生[45,46]。

一些去泛素化酶抑制剂也被用于临床病毒性感染的治疗。P22077和PR-619是USP7和USP47特异性抑制剂，在HIV-1感染时，能够抑制Gag加工并降低感染性病毒体的释放。此外，在用这些抑制剂治疗时，人淋巴组织中X4-和R5-嗜性HIV-1NL4-3的复制能力降低，但不影响宿主细胞活力。最引人注目的是，在单一治疗无效的情况下，去泛素化酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂联合治疗时可以协同阻断病毒复制，表明去泛素化酶抑制剂可以提高蛋白酶体抑制剂的疗效[47]。SARS-CoV编码的去泛素化酶PLpro能切割泛素和ISG15结合物，帮助SARS-CoV逃避人体免疫系统。GRL0617是PLpro的竞争性抑制剂，发挥抗病毒活性，抑制SARS-CoV的病毒复制[48]。IU1，一种蛋白酶体相关的USP14小分子抑制剂，能够抑制几种黄病毒的复制，它对登革热病毒复制的抑制作用比黄病毒更明显[49]。

IFN-Ⅰ是重要的抗病毒药物，广泛用于各种病毒感染的临床治疗。到目前为止，DUBs在调节IFN-I抗病毒活性中的作用研究较少。UCHL3能上调SCFβ-TrCP底物COPS5的去泛素化水平，维持细胞COPS5蛋白的水平和稳定性，增强IFN-I介导的抗病毒活性[50]。进一步全面系统的研究去泛素化介导的Ⅰ型IFN信号传导和抗病毒功能的调节，能够为抗病毒治疗提供新策略。

6 展望

去泛素化作为一种校对机制来提高蛋白质标记破坏的准确性，这种去除泛素标签也是调节蛋白生物活性的手段。不恰当的泛素修饰、DUBs的异常调节都可能影响许多细胞过程，导致各种相关疾病。与泛素连接酶研究的广泛文献相比，目前仍然缺乏对DUBs调控机制及效应的研究。深入理解DUBs的效应及机制，将有助于DUBs抑制剂运用于临床，并为药物开发提供理论基础。尝试开发针对DUBs的特异性和有效药物将有助于随后阐明这类分子靶点在正常和疾病状态下的作用，而以DUBs为靶点的抗病毒治疗研究也具有十分重要的应用前景。