复方苦参注射液质量控制方法研究进展

1.天津中医药大学中药制药工程学院，天津 300193； 2.浙江大学药物信息学研究所，浙江 杭州 310058； 3.山西振东制药股份有限公司，山西 长治 047100

复方苦参注射液(Compound Kushen Injection, CKI)是由苦参、白土苓两味药材经渗漉、煎煮、醇沉等一系列精制工艺而制成的中药注射剂，收载于卫生部药品标准[1]。CKI具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛之功效[2]。常用的质量分析方法包括薄层扫描法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等，检测指标多为苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱和氧化槐果碱等生物碱类化合物，主要来源于苦参药材，另有来源于白土苓的大泽米苷，报道较少。本文对文献报道的CKI质量控制技术进行调研，分析各方法的优势与不足，以期为建立该品种更为完善的质量控制体系提供参考。

1 复方苦参注射液质量控制方法

1.1 酸碱滴定法 酸碱滴定法是利用酸碱反应并通过滴定操作测定物质含量的一种分析方法，是一种经典含量测定技术，但由于某些物质溶解度较差，在水中进行酸碱滴定受到一定限制，常需要采用各种非水溶剂作为介质进行滴定[3]。CKI的部颁标准采用酸碱滴定法测定苦参总碱的含量。步骤如下：精密吸取本品0.5 mL，置于100 mL具塞锥形瓶中，置水浴上蒸干后，加浓氨试液0.35 mL使溶解，然后加氯仿20 mL，密塞，摇匀，室温放置过夜，置水浴上蒸干，残渣加中性乙醇(对甲基红指示剂显中性)5 mL使溶解，蒸干，残渣加乙醚6 mL使溶解。精密加硫酸滴定液(0.01 mol·L-1)10 mL，摇匀，置水浴上加热使残渣完全溶解并除尽乙醚，放冷。加新沸过的冷水20 mL与甲基红指示剂2滴，用氢氧化钠滴定液(0.02 mol·L-1)滴定至橙黄色，结束滴定。每1 mL的硫酸滴定液(0.01 mol·L-1)相当于4.976 mg的苦参碱(C16H24N2O)[4]。这种方法测定苦参总碱的含量，可弥补单个生物碱含量测定的不足，但是操作烦琐、专属性差、成本高、时间长，对操作人员的技术要求也较高，限制了该方法的广泛应用。

1.2 薄层色谱法 薄层色谱法系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，形成均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。宋茹等[5]采用用薄层扫描法对CKI中苦参碱进行了含量测定，以甲苯-丙酮-乙醇-氨水(10∶10∶1∶0.1)为展开剂，在CS -9000 飞点薄层扫描仪上以反射式锯齿扫描方式(λ=515 nm)进行测定，结果表明：样品含量在2.16～7.56 μg范围内呈良好线性关系，决定系数为0.9992，平均回收率达到99.0 %，RSD为0.61%(n=6)。该法简便快速、重现性满意，但是需要专用设备，耗时也较长，不适合大量样本的采集和分析。

1.3 气相色谱法(GC) GC的分析原理是使混合物各组分在固定相和流动相之间进行分配，当流动相中所含的物质经过固定相时，就会与固定相发生相互作用。由于各组分性质和结构上的不同，相互作用的大小、强弱有差异，因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中滞留时间有一定差别，从而按移动速度大小次序依次从固定相中流出。

江林等[6]建立了填充柱气相色谱测定苦参及其制剂中的苦参碱类生物碱的方法。该方法采用1 m长的OV-17色谱填充柱，检测器及汽化室温度设为320 ℃，升温方式为150 ℃→250 ℃(250 ℃，保持3 min)、250 ℃→300 ℃(300 ℃，保持2 min)、升温速度均为20 ℃·min-1的实验条件。该方法对由数种中草药(含苦参)组成的醇提取液有满意的精密度(RSD=1.9%,n=11)及回收率(98.3 %)。通过对苦参碱、氧化苦参碱的填充柱色谱行为与毛细管柱色谱-质谱行为对比，得知填充柱色谱峰为苦参总碱。该方法可应用于各种苦参制剂中苦参总碱含量的直接测定以及原药采集和生产过程中的质量监测，在当时被某生产以苦参为主要制剂成分的企业所采用并编入企业标准，成为其原料采集、生产监控和成品检验的主要手段，取得了当地技术监督部门的认可。该技术测定的仍是苦参总碱的含量，不能分别测定各种单体生物碱的含量，而且由于苦参生物碱类化合物挥发性并不理想，未必适合进行GC测定。

1.4 毛细管电泳法(CE) CE技术兼有电泳和色谱技术的双重优点，该技术以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(电荷大小、等电点、极性、亲和行为、各组分之间淌度、相分配特性等)为依据的液相分离分析技术。饶毅等[7]采用CE法测定了CKI中苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱的含量。采用未涂层石英毛细管(57 cm×50 μm i.d.)作为分离通道，分离电压为12.5 kV，缓冲体系为：0.2 mol·L-1Tris-40 mmol /L磷酸二氢钠(pH 5.50)-20%异丙醇，检测波长设为200 nm，以氢溴酸东莨菪碱为内标，缓冲液中添加有机改性剂可以显著改善分离。CE已日益广泛地应用于中药化学成分的分离和含量测定，该法简便快速，有较好的重现性，而且分析成本较低，并可减少有毒试剂(包括流动相)的使用，可作为许多中药有效成分的分离和质量控制方法。

1.5 高效液相色谱法(HPLC) HPLC法作为一种高效、快速的分离、分析技术，以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域应用最为广泛的现代分析技术之一。王智民等[8]建立了同时测定CKI中苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱的含量的HPLC方法，所用色谱柱为Alltimaamino色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、流动相为乙腈-3%磷酸溶液-无水乙醇(80∶10∶10)、流速为1.0 mL·min-1、柱温为30 ℃、检测波长为220 nm，方法回收率：苦参碱为99.5%(RSD=1.58%)，槐定碱为99.2%(RSD=1.44%)，氧化苦参碱为100.2%(RSD=1.85%)。研究过程中曾尝试尝试将注射剂直接稀释进样，但发现样品溶液在上述色谱条件下杂质干扰较强，3种生物碱无法得到基线分离。故采用浓氨水将注射剂调为碱性，使生物碱游离出来后，用氯仿少量多次萃取，挥干氯仿，无水乙醇稀释进样，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱均能得到良好分离。

反相离子对色谱法是把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电荷的中性离子，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。反相离子对色谱法无需衍生或使用特殊色谱柱，具有反相色谱法操作简便和分离柱效高等固有优点。张蕾等[9]建立了同时测定CKI中氧化苦参碱和苦参碱含量的方法，方法采用离子对RP-HPLC法，实验条件为Hypersil ODS2色谱柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)、流动相为甲醇-乙腈-水-磷酸(10∶ 30∶65∶0.05)，含33m mol·L-1的SDS)、流速为1.0 mL·min-1、检测波长设为210 nm、柱温为室温。实验考察了酸度和离子对试剂种类对组分色谱行为的影响，结果表明，庚烷磺酸钠的分离效果较好，但该试剂价格昂贵，因而选用了价格相对较低的十二烷基硫酸钠，结果显示氧化苦参碱、苦参碱分别在17.44～174 .4 μg· mL-1(r=0 .9996,n=6)和1.96～39.20 μg· mL-1(r=0 .9997,n=6)范围内呈良好线性关系，平均回收率分别为100.4%(RSD=2.1 %,n=9)和99 .7 %(RSD=1.4 %,n=9)。陈晨等[10]建立反相离子对色谱同时测定CKI中苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱含量的方法，该方法采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)色谱柱、流动相为0.04%磷酸-10 mol·L-1戊烷磺酸钠水溶液和乙腈、线性梯度洗脱、流速为1.2 mL·min-1、柱温30℃、检测波长 210 nm的实验条件，实验分别尝试了在流动相中加醋酸、氨水、三乙胺、磷酸盐、十二烷基磺酸钠、戊烷磺酸钠等添加剂，结果十二烷基磺酸钠和戊烷磺酸钠离子对试剂均能明显改善4个生物碱峰的峰形，而戊烷磺酸钠能使4个生物碱实现良好分离，最终选择以戊烷磺酸钠离子对试剂为添加剂。实验结果得到苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱质量浓度分别在18.92～946.0 mg·L-1，4.052～202.6 mg·L-1，9.293～464.6 mg·L-1，34.73～1736 mg·L-1范围内线性关系良好，相关系数均为0.9999；重复性试验中4个生物碱的RSD均小于2.1%；平均加样回收率分别达到98.2%，96.4%，96.9%，97.1%。

HPLC方法为CKI质量控制的经典方法，该方法可将各种生物碱进行有效分离后进行准确测定，一般也作为标准方法使用。但生物碱类化合物在样品中以分子态和离子态两种形式共存，必须通过严格控制pH值或加入对离子的方式，维持其分子态，从而可在色谱柱上保留，因此测定过程较为复杂，分析工作效率不够理想。

1.6 液相色谱-质谱联用(HPLC-MS) HPLC-MS是以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统的一种分析技术，它集HPLC的高分离能力和MS的高灵敏度、高选择性于一体，弥补了传统液相检测器的不足，尤其适用于在紫外区域无特征吸收，或含量较低的化合物的分析测定。刘倩等[11]建立了含苦参的复方制剂HPLC-MS鉴定方法。其中，液相色谱采用梯度洗脱，质谱用正离子模式检测。主要的实验条件如下：色谱柱：Hypersil BDS(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A：0.1氨水，B：甲醇；梯度洗脱：0 min：A：B(80∶20)，30 min：A：B(80∶20)，50 min：A：B(40∶60)，流速设为0.5 mL·min-1，共从CKI中分离鉴定了11种化学成分，其中苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱均为苦参碱型生物碱，此外尚有金雀花碱型、无叶豆碱型、羽扇豆碱型生物碱以及大量的同分异构体。在上述色谱条件下，采用苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱标准品进行确证，结果发现4种标准品色谱图和质谱图同上述复方苦参碱注射液中对应成分在保留时间，准分子离子和碎片离子吻合，验证了上述结果的准确性。

HPLC-MS法集色谱分离及质谱定性检测能力于一体，对于复杂混合物具有良好的分离和表征能力，可以简便快速的获得各化合物的分子结构信息，进行定性分析。本法简便，快速，可用于中药复方化学成分的分析。但仪器价格昂贵，分析成本较高，不适于大批量样品的日常分析检测。

1.7 近红外(Near infrared, NIR)光谱法 目前，对复方苦参注射液的质量控制研究均需要复杂的样品预处理，成本高，时间长，不太适合CKI生产过程中中间体的快速分析，而注射液生产过程中中间体的快速分析对于产品的过程质量控制是非常重要的。在此背景下，NIR光谱分析技术成为一种新的选择，该技术通过选择适当的化学计量学方法，把校正集样品的NIR吸收光谱与其成分浓度或性质数据进行关联，建立二者之间的定量校正模型。在进行未知样品预测时，应用已建好的校正模型和未知样品的吸收光谱，就可定量预测其成分浓度或性质，该技术具有快速，同时测量多种理化性质、绿色环保及操作方便等特点。

陈晨等[12]建立了CKI生产过程中两类中间体(醇沉液和碱沉液)中4 种生物碱含量的快速测定方法，探讨中药制剂中间体质量控制的有效途径。研究分别采用NIR透射和透反射模式采集样品光谱，比较不同光谱采集方式的建模效果并优选出最佳建模参数，在此基础上采用偏最小二乘回归(PL-SR)算法建立NIR光谱与参考值之间的校正模型，并对未知样品的含量进行预测。实验结果表明，建立的苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱模型性能良好。醇沉液模型的预测误差均方根(RMS-EP)分别为：0.131 g·L-1、0.0279 g·L-1、0.170 g·L-1、0.613 g·L-1；碱沉液模型则分别为0.0723 g·L-1、0.0155 g·L-1、0.0768 g·L-1、0.220 g·L-1。该团队还报道采用NIR透反射光谱技术，对CKI渗漉液中多组分的量进行快速测定[13]。该方法采用氧化槐果碱、氧化苦参碱的HPLC 测定值，总糖的苯酚-硫酸法测定值及固体总量的烘烤法测定值为对照值，用偏最小二乘法建立近红外光谱与对照值之间的校正模型，并对未知样品进行定量预测。结果表明，校正模型对氧化槐果碱、氧化苦参碱、总糖和固体总量4 种组分的交叉验证均方根误差(RMSECV)分别为43.5、135.4、1255.7 mg·L-1和150.7 mg· mL-1，经外部验证，预测均方根误差(RMSEP)分别为32.5、191.7、1 461.9 mg·L-1和164.0 mg· mL-1。证明所建模型具有满意的拟合效果和预测能力，目前已用于复方苦参注射液渗漉过程的快速分析。与传统测定方法相比，NIR光谱技术耗时短，测定结果准确，无需样品预处理，大大节约了时间和成本，尤其适用于大批量样品的快速分析，且可通过光纤实现远程测定和在线测定，在工业生产上极具推广应用价值。

2 结语

本文简要介绍了复方苦参注射液质量控制的7种方法，并对其优缺点进行评述。目前复方苦参注射液的质量控制还局限于测定源自苦参药材的一些生物碱类化合物，而白土苓作为一味原料药材，其质量标志物(Q-Marker)并未在最终产品的质量控制中得以体现，这复方苦参注射液质控技术的主要不足之处。复方苦参注射液生物碱类化合物的含量测定目前主要采用HPLC方法，但仍需要探索采用新型色谱柱和新的样品预处理方法，以简化操作步骤，提高分析效率。CE技术也可以用于测定CKI 中生物碱类化合物含量，成本低、效率高，是一种新的选择。NIR光谱技术作为一种复方苦参注射液质量控制的新型的方法，具有耗时短、测定结果准确、可实时在线监控等优势，适应了工业分析的需求，大大节约了时间和成本，适用于大批量样品的分析，非常适合于中药中间体的检测及复方苦参注射液的全程质量控制。