非啮齿类动物在生殖毒性试验中的应用进展

张元慧，蒋建东，孔维佳*

(1.中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所，北京 100050；2.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050)

随着医疗水平的提高，新生儿畸形现象正在逐渐减少，然而不孕不育症却愈发严重，据最新文献报道，全球范围内大概有20%的人患有不孕不育症[1]，这引起了人们对生殖毒性研究的重视。生殖毒性是指外源因素(如药品、食品添加剂、环境污染物、辐射)对亲代生殖功能和子代生长发育所产生的有害作用[2]，该研究是安全性评价的重要内容。在进行生殖毒性试验时，实验动物的选择对于研究具有重要意义，一般会采用两类动物进行实验，即啮齿类动物和非啮齿类动物。非啮齿类动物通常会选择家兔，在一些特殊条件下也会选择其他动物进行实验，如犬、小型猪或非人灵长类动物。生殖毒性研究主要根据受试物的药代动力学特点、药理学和毒理学信息进行判断，通常选择对受试物的体内代谢过程以及毒效学参数与人体相似的实验动物[3]。目前，对于非啮齿类动物在生殖毒性研究中的应用资料较少。因此，本文根据不同实验动物的自身特点，对各种非啮齿类实验动物模型在生殖毒性研究中的现状进行总结，旨在为科研工作者选择合适的动物模型提供一些参考。

1 家兔

家兔作为生殖毒性研究的动物模型具有很多优点：无发情期，一年四季均可交配繁殖；妊娠期较短，一般为30～33 d；繁殖能力强，每胎产仔数7～12只[4]。家兔属于刺激性排卵动物，经过交配的刺激后可进行排卵。其胎盘是血窦内皮型，与人类的血窦绒毛型胎盘较为相似。生殖道与人类最接近，适用于评价避孕药和局部用的药物(如凝胶剂、阴道环等)[5]。

在对新型左炔诺孕酮和炔雌醇复方避孕贴剂进行安全性评价时，研究人员选用了新西兰家兔进行实验，多次给予此避孕帖后家兔的体内并未发生药物蓄积[6]。Susheela等人[7]在研究饮用水中超标氟化物对生殖功能的影响时，发现氟化处理可导致家兔精小管退化、抑制精子生成，这与氟化物对人体产生的影响一致。另有研究发现，在停药期间给予家兔维生素D和E可以修复氟化物引起的生殖功能损伤[8]，这为超标氟化物引起的不孕不育症提供了新的治疗手段。

家兔由于具有上述优点，在生殖毒性试验中应用最多，积累了丰富的基础数据。但家兔是食草动物，对能够引起消化道功能紊乱的化学物质以及抗生素类药物较敏感，临床表现难以解释，因此不适合评价此类物质。

2 犬

犬无需借助电刺激等痛苦的采精技术即可获得精子，因此常用于精子数量、成熟度和活力测定的分析研究[9]。目前国际公认的标准实验用犬为比格犬，其具有体型小，性情温顺，便于实验操作的优点[10]。同时，其生理生化指标稳定，实验结果的重复性好，遗传学资料丰富[11]。另外，比格犬易于驯化，能够采用注射等在其他实验动物不宜操作的给药方式[12]。

羟胺基组蛋白去乙酰化酶抑制剂HZ1006是一种有临床应用前景的抗癌药物，研究者选择了比格犬作为该药物临床前毒性评价的动物模型，实验表明男性生殖道、消化道、呼吸道和血液系统可能是HZ1006的毒性靶点，提示该药物可能存在一定的生殖毒性[13]。另有研究者发现犬对谷物中广泛存在的玉米赤霉烯酮的毒性作用敏感，幼龄雌犬接触低剂量玉米赤霉烯酮可引起子宫和卵巢功能异常，类固醇激素发生变化，生育能力下降[14]。

但是，犬是季节性繁殖动物，只在春秋季发情，产仔数量变动较大，每胎2～10只不等，并且存在近亲繁殖因素的影响，这些特点均限制了犬在生殖毒性试验中的应用。已有文献表明犬对抗高血压药物、拟交感神经药物和非甾体抗炎药物的反应与人体存在较大差异[15]，因此不适用于此类药物的安全性评价。

3 小型猪

小型猪在生理学和解剖学等方面与人类有很多相似性，具有胎仔数量多、性成熟时间短等优点。动情周期、子宫组织学和精子学资料与人类非常接近[16]。有证据表明[17]，小型猪对很多人类致畸物质敏感，如乙醇、羟基脲、维甲酸、沙利度胺、氨基蝶呤等。相对于其他实验动物，小型猪对这些化合物的反应性可能更具有参考价值。

在进行维甲酸的致畸作用研究时，研究人员选用了哥廷根小型猪进行实验，证实了维甲酸的致畸作用非常明显[18]，该研究结果显示，随着给药剂量的增加，胎仔畸形发生率不断上升，畸形程度也越来越严重，且畸形表现与人类的视黄酸胚病(小颌、小耳、腭裂、心脏和胸腺的缺陷、中枢神经系统异常)极为相似。另外，Hayama等[19]发现在器官形成期给予孕猪乙嘧啶可导致上腭裂等结构性缺陷，也可引起后肢瘫痪等功能性缺陷。美国食品药品监督管理局在2013年批准上市的新药阿法替尼[15](主要用于治疗晚期非小细胞肺癌和晚期乳腺癌)，在其临床前安全性评价中，由于犬发生严重的胃肠道反应，研究人员选用了哥廷根小型猪进行安全性评价，表明小型猪在新药临床前研究中具有良好的应用前景[20]。

目前，小型猪在生殖毒性评价方面的应用还存在一些局限性。首先，小型猪的体型较大，导致实验人员的操作难度增加，操作过程中体能消耗较大。其次，目前尚无用于研究的商业试剂盒[21]，给实验带来一定困难。最后，小型猪的胎盘不能转移大分子物质，无法用于抗体、疫苗等生物制品的安全性评价。

4 非人灵长类动物

非人灵长类动物与人类的生殖系统具有很多相似性，首先两者均是单胎妊娠，内分泌系统对生殖功能的调控都是通过下丘脑-垂体-卵巢轴进行[22]，均在更年期阶段丧失生育能力。女性的生理周期一般是30 d左右，而雌猴一般是28 d[23]。雌猴生殖道的生理结构，包括输卵管、子宫和阴道均与人类具有可比性。胎盘的生理结构和转移机制等方面也与人类相似[24-25]。

非人灵长类动物在比较胎儿和新生儿发育能力方面具有极大优势，特别是脑部发育。与大脑发育不成熟的啮齿类动物不同，新生恒河猴在出生时脑白质明显增多，这使得恒河猴成为评估不良妊娠(如胎盘功能不全、胎儿生长受限和子痫前期)导致新生儿认知和行为异常的良好模型[26-27]。

Frias等人[28]通过研究发现，雌性恒河猴长期接触尼古丁(接近怀孕女性吸烟者的水平)后，胎盘血流量在短期内降低，绒毛组织学异常。然而，联合服用抗坏血酸药物(如维生素C)减轻了这些变化。这些研究表明产前接触尼古丁对胎盘结构和功能产生有害作用，并为补充维生素C可以减弱孕期吸烟的一些不良影响这一发现提供了新的证据。

虽然非人灵长类动物生殖系统的结构和功能与人类最为相近，在生殖毒性研究中具有极大的应用价值，但其价格昂贵，资源稀缺，对于实验方案设计和执行均有一定挑战。另外，非人灵长类动物面对极大的动物福利压力和伦理挑战，进一步限制了其在此类研究中的应用。

5 斑马鱼

斑马鱼的基因组与人类的基因相似度高达87%[29]，这使其成为人类疾病研究的良好动物模型。在生殖毒性试验中，斑马鱼具有其他动物无法比拟的优点：生殖周期短，每次产卵数量多，胎仔发育迅速。个体小，对环境适应力强，可以减少实验周期和成本。在早期发育阶段通体透明，便于开展胚胎、胎仔的发育研究[30-31]。另外，斑马鱼和人类的生殖调控系统具有高度相似性，这使得研究人员能够通过研究斑马鱼的重要神经元，以及生殖激素及其作用效果来全面地研究和理解人类生殖系统[32-33]。

随着研究的不断深入，斑马鱼逐渐成为科学家们评估人类生殖系统潜在危险化合物的良好动物模型，特别是评估环境污染物。以哺乳动物为主的评估生殖毒性的分析方法耗时、复杂且昂贵，需要进行大规模的实验分析[34]。同时，哺乳动物往往需要较高剂量，但环境中化学物质的浓度水平往往较低[35]，从而导致现实环境的毒性水平无法预测。而微量的化合物在较短的时间内就可以进入斑马鱼体内，因此斑马鱼可以作为环境污染物研究的最佳实验动物模型。此外，斑马鱼易受基因操纵，为研究基因对繁殖的影响提供了一个新的选择[36]。

Webster等人[37]将斑马鱼暴露于除草剂草甘膦后，发现斑马鱼cyp19a1基因的表达上调、芳香化酶的活性以及卵巢中主要雌激素受体esr1的表达均显著增加，从而揭示草甘膦对斑马鱼生殖器官的类固醇合成具有破坏作用。Lopes等人[38]在暴露于草甘膦的成年雄性斑马鱼中也观察到抗氧化基因的上调和精子运动性降低的现象，这表明草甘膦在诱导睾丸氧化应激方面具有一定作用。这与许多人类细胞体外研究结果一致[39]，均揭示了草甘膦通过破坏激素合成、抑制芳香化酶活性而使精子和卵子质量下降，最终导致胚胎早期发育阶段死亡率上升。

迄今为止，斑马鱼作为生殖领域的研究模型只有十几年[40]，与其他传统的高等脊椎动物相比，其生殖系统的基础资料明显缺乏，特别是对雄性生殖系统的了解还很有限。另外，斑马鱼是卵生动物，交配方式是体外受精，这与人类的繁殖方式存在巨大差异。

6 小结

综上所述，在评价避孕药、凝胶剂和阴道环等局部给药的药物时可以优先考虑家兔作为研究对象。评价孕激素类和生育调节药物时，非人灵长类动物是最好的选择。斑马鱼适用于评价环境污染物和作用于中枢神经系统的药物。犬不适合评价抗高血压药、拟交感神经药和非甾体抗炎药。小型猪不适合评价抗体、疫苗等大分子药物。所有动物模型都有其优点和局限性，家兔胎仔数量多、便于操作，但是食草性动物，消化道与人类存在差异。犬生理指标稳定、结果的重复性好，但犬是季节性繁殖，给实验设计带来较大困难。小型猪对某些致畸物质的反应与人类存在相似性，但其胎盘无法转移大分子物质。非人灵长类动物是单子宫、有月经周期，但价格昂贵、资源稀缺、动物福利压力大。斑马鱼与人类基因高度一致，在发育前期通体透明、便于观察，但斑马鱼是卵生动物，繁殖方式与人类存在一定差异。因此，在研究人类生殖毒性时，并没有单一的理想动物模型，应根据受试物的理化性质、与人体的相互作用以及实验动物的特点进行综合考量，选择最适合的动物模型，在一定条件下也可采用多个动物模型进行评价。