桑黄原生质体的制备与再生研究

白静莹 王立山 张 媛 范桂枝

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150000）

桑黄（Phellinus yucatanenisis）属于担子菌亚门、多孔菌目、多层孔菌科、针层孔菌属[1]，是一种珍贵而功效多样的药用真菌，有“森林黄金”之美称。桑黄最早使用记录是从汉朝开始的，至今已有2000多年的历史，中医用以治疗血崩、血淋、带下、脾虚泄泻等[2-3]。现代药理研究表明，桑黄含有多糖、黄酮、三萜酸、脂肪酸类、芳香酸等成分[4]，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗肝纤维化和增强免疫等药用价值[5-6]，是国际公认的最佳抗癌真菌之一。因此，桑黄作为名贵的滋补药材，市场对其需求骤升。

野生桑黄人工栽培难度大、子实体生长周期长，一般3～4年，这限制了对桑黄的进一步开发和利用。为了满足日益增长的市场需求，选育性状稳定、子实体生长周期短和人工栽培难度小的桑黄菌种成为一项重要的工作。原生质体技术是选育优良菌种行之有效的手段，如原生质体融合、原生质体诱变和原生质体基因转化等。其中，原生质体的制备和再生是原生质体技术的前提和基础。祝子坪和马海乐[7]、许谦[8]的研究分离了桑黄菌丝原生质体并成功再生，但是上述研究均未报道桑黄菌种的寄生树种。研究表明，桑黄孔菌属（Sanghuangporus）常与其所生长的树木之间存在种类专一性关系[9]，目前知道世界上桑黄属有12种[10-12]，主要生长于杨、松、桑、白桦、暴马丁香、杜鹃等树的树干上[13]。不同寄生树种来源的桑黄菌丝中，药用代谢物含量可能存在差异[14]，其分离的原生质体活力、产量和再生能力是否相同还未见报道。为此，笔者将比较分析来源于暴马丁香、桑树、松树、桦树、杨树桑黄等五种桑黄菌丝的原生质体活力和产量以及葡萄糖和pH对原生质体再生的影响，为利用原生质体技术选育优良桑黄菌种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、试剂与培养基

1.1.1 供试材料

五种不同树种的桑黄子实体分别为暴马丁香桑黄（Sanghuangporus baumii）、桑树桑黄（Sanghuangporus sanghuang）、松树桑黄（Phellinus igniarius Linn）、桦树桑黄（Phellinus igniarius）、杨树桑黄（Sanghuangporus vaninii），均由东北林业大学生命科学学院森林生物工程学科实验室提供，该菌种已从形态和分子水平鉴定[15]。

1.1.2 主要试剂

崩溃酶（北京索莱宝科技有限公司），蜗牛酶（北京百泰生化技术公司），二乙酸荧光素（FDA）（上海瑞永生物科技有限公司），由本地市场购得葡萄糖、甘露醇等均为分析纯。

1.1.3 培养基

液体培养基：马铃薯200 g沸水煮30 min，4层纱布过滤。取滤液，加入20 g葡萄糖，补水至1000 mL，pH自然。

PDA培养基：PDB培养基再加10%琼脂粉。

原生质体再生培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母粉4 g，溶于0.6 moL/L渗透压稳定剂中，体积为1000 mL，加入10%琼脂粉，pH自然。

1.2 主要仪器与设备

电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），超净工作台（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司），SHA-B水浴恒温振荡器（国旺仪器），TDZ5-WS台式低速离心机，OLYMPUS荧光显微镜，酒精灯，移液枪，镊子，0.22µm细胞筛，0.22µm微孔滤膜，尼龙纱布（64µm）等。

1.3 试验方法

1.3.1 桑黄菌丝体的培养

取PDA斜面上生长旺盛的菌丝，接种于PDB培养基中，28℃，130 r/min恒温震荡培养15 d左右，直至菌丝长成约1 cm的球状。

1.3.2 原生质体制备

在超净工作台上，将五种桑黄菌丝用无菌水洗涤、去除表面水分后，每毫升酶解液加入300 mg菌丝，振荡混匀，使酶液与菌丝体充分接触。于35℃恒温水浴锅水浴，110 r/min振荡酶解3 h。待酶解完成后，将五种桑黄菌酶解液用无菌双层尼龙纱布（64µm）过滤，3800 r/min离心机离心10 min去上清液，将原生质体用渗透压稳定剂稀释成悬液备用。

1.3.3 原生质体产量与活力统计

（1）原生质体活力测定（FDA染色法）：用丙酮将FDA配置成5 mg/mL溶液，将FDA溶液与原生质体悬液按比例1∶1混匀，分别在自然光与荧光显微镜下观察五种桑黄的原生质体。在荧光显微镜下，有活力的原生质体发出绿色荧光，无活力的不发光。随机选取3个视野，每个样品重复3次，计算出在自然光下原生质体数和荧光下有活力的原生质体数，得出活力比。

原生质体活力比（%）=荧光下原生质体数（个）/自然光下原生质体数（个）×100

（2）原生质体产量的测定（血球计数板计数）：吸取五种桑黄原生质体悬液10µL于25×16血球计数板上，在显微镜下，分别在左上、右上、左下、右下、中间五个中方格，计数原生质体数目。每个样品重复3次。

原生质体产量的计算：

原生质体的产量/mL=（a/5）×25 ×104×b

式中：a为5个中方格中原生质体总数；b为原生质体悬液稀释倍数。

1.3.4 暴马丁香桑黄的再生

1.3.4.1 不同葡萄糖浓度对暴马丁香桑黄再生率的影响

取1000 mL马铃薯滤液，平均分为两份，即对照组和试验组。试验组加入54.65 g甘露醇使其浓度为0.6 mol/L，然后试验组和对照组平均分成五份，分别加入一定量葡萄糖使其葡萄糖浓度分别为0.01 g/mL、0.02 g/mL、0.03 g/mL、0.04 g/mL、0.05 g/mL，pH自然，每份加1 g琼脂，溶解后121℃、灭菌20 min。每个样品重复3次。

1.3.4.2 不同pH对暴马丁香桑黄再生率的影响

取1000 mL马铃薯滤液，加入葡萄糖20 g，平均分为两份，即对照组和试验组。试验组加入54.65 g甘露醇使其浓度为0.6 moL/L，然后试验组和对照组平均分成五份，调节pH为一定值。每份加1 g琼脂，溶解后121℃、灭菌20 min。桑黄菌丝生长最适pH为 7.5，所以设定pH 五个梯度为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。每个样品重复3次。

1.3.5 释放与再生的观察

（1）桑黄原生质体的释放：在酶解过程中，每隔1 h取样制片，在显微镜下观察原生质体形成情况。（2）桑黄再生：在无菌操作台将桑黄精制后的悬液浓度调整为1×105个/mL，吸取100µL悬液涂到基础培养基上，27.5℃避光条件下培养，随时取样制片，观察桑黄原生质体再生过程。

2 结果与分析

2.1 原生质体的形态观察

菌丝在酶解的过程中细胞壁被分解去除，形成的原生质体没有了坚硬的细胞壁束缚，形态就会变为球形或者近球形。暴马丁香、桑树、松树、桦树、杨树桑黄菌丝分别经酶解液精制后得到的原生质体形态如图1所示。五种桑黄菌丝的原生质体形态变为球形或近球形，但杨树桑黄原生质体形态与其他四种相比较不规则，可能是由于没有了细胞壁的阻隔，原生质体可能会发生自然聚集或融合。进一步从荧光显微镜图片可以看出桑树和桦树桑黄释放的原生质体相似，均为细胞膜附近荧光较强，而暴马丁香、松树和杨树桑黄释放的原生质体相似，原生质体表面均有荧光分布。

2.2 原生质体的活力分析

暴马丁香、桦树、松树、桑树、杨树桑黄的原生质体活力比分别为81.82%、76.67%、76.47%、71.58%、71.11%（图2）。其中，暴马丁香桑黄原生质体的活力最高，杨树桑黄原生质体的活力最低，杨树桑黄比暴马丁香桑黄原生质体的活力降低了10%。

2.3 原生质体的产量分析

暴马丁香、桦树、松树、桑树和杨树桑黄原生质体的产量分别为 3.85×105个/mL、3.14×105个/mL、2.85×105个/mL、3.57×105个/mL 和 2.42×105个/mL（图3）。其中，暴马丁香桑黄的产量最高，杨树桑黄原生质体的产量最低，杨树桑黄比暴马丁香桑黄原生质体产量降低了1.43×105个/mL。

图1 不同树种桑黄原生质体镜检图（10×60）

图2 桑黄原生质体活力比

图3 桑黄原生质体产量

图4 不同pH对原生质体再生的影响

图5 不同葡萄糖浓度对原生质体再生的影响

2.4 pH和葡萄糖浓度对桑黄菌丝原生质体再生率的影响

由上述图2和图3可知，暴马丁香桑黄菌丝原生质体的活力比和产量最高，为此采用其分析pH和葡萄糖浓度对桑黄菌丝原生质体再生率的影响。pH 6.5～8.5，试验组和对照组桑黄菌丝原生质体的再生率呈先上升后下降趋势，其中试验组在pH7时再生率达最高值23.67%，对照组在pH7.5时再生率达最高值23.34%（图4）。

葡萄糖浓度对桑黄菌丝原生质体再生率的影响如图5所示。葡萄糖浓度在10～50 mg/mL，试验组呈先升高后降低趋势，葡萄糖浓度在30 mg/mL时，原生质体再生率最高值19.33%，而对照组葡萄糖浓度在50 mg/mL时，原生质体的再生率最高为14.66%，其他葡萄糖浓度下再生率均在12%左右。

2.5 原生质体释放与再生过程

桑黄菌丝酶解1～3 h，随着酶解时间的增加，桑黄菌丝的细胞壁首先被降解，原生质体从侧端释放（图6a），在酶解中期（图6b、c），大部分菌丝被酶解为片段。该酶解过程与文献报道一致，即大量菌丝由侧端与顶端位膨胀，释放更多原生质体[16]，被释放后的原生质体在渗透压稳定剂作用下，呈现椭圆形或不规则形状（图6d）。

图6 原生质体释放与再生过程镜检图（10×60）

桑黄原生质体再生过程中，桑黄原生质体首先萌发变成短状棒粗菌丝（图6e），短状棒菌丝聚合进而再转化为菌丝体（图6f），菌丝体通过大量繁殖聚集变成桑黄菌株（图6g、6h）。

3 小结

试验以暴马丁香、桦树、松树、桑树、杨树桑黄等五种桑黄为原料，进行了桑黄原生质体活力与产量的测定。选用暴马丁香桑黄为材料，研究pH 6.5～8.5和葡萄糖浓度10～50 mg/mL对原生质体再生的影响，并对暴马丁香桑黄原生质体释放与再生过程进行显微摄影观察。结果表明：试验所测定的五种桑黄中，暴马丁香桑黄原生质体活力与产量最高，分别为81.82%和3.85×105个/mL。在pH 7时，暴马丁香桑黄再生率最高为23.67%，葡萄糖浓度为30 mg/mL时，暴马丁香桑黄的再生率最高为19.33%。初步摸索了桑黄菌株采用酶解法获得的原生质体进行释放与再生历程，为以后该菌种诱变体系的建立奠定基础。