液体发酵高产灵芝多糖培养基的筛选与配方优化

冯东英 杨 宁 刘 爽 戴洪琨 贾传福 杜新永

（聊城大学农学院，山东聊城252000）

灵芝（Ganoderma lucidum）属担子菌纲多孔菌目多孔菌科灵芝属，是我国传统的药用真菌，具有较高的药用价值和经济价值。近年来文献报道表明，灵芝多糖是灵芝中最重要的活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等[1-3]多种功效。而且，毒理学临床实验表明，灵芝多糖不会对人体健康造成负面影响[4]。

培养基对于灵芝菌丝生长、多糖产量有显著的影响。灵芝液体深层发酵，一般选择蛋白胨、酵母泥、麸皮、米糠[5-8]等作为培养基，也有采用中药渣[9]，均取得了不错的结果。试验选择了酵母泥、黄豆粉、玉米粉、麸皮以及中药药渣作为培养基主要成分，对灵芝液体发酵培养基进行优化，以期获得最佳的灵芝多糖高产配方。

1 材料与方法

1.1 供试材料

灵芝菌种（泰山赤芝），由山东聊城冠县灵芝栽培基地提供；蛋白胨为国药集团产品，自购；中药渣由青岛润达生物科技有限公司提供；酵母泥由杭州美亚生物科技有限公司提供。

1.2 供试培养基

灵芝基础培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，去离子水1000 mL。

供试培养基（酵母泥、玉米粉、黄豆粉、麸皮、杂木屑、黄芪药渣、甘草药渣、金银花药渣）按干重20 g/L的量添加到基础培养基中，为保证发酵效果，保留5 g/L的蛋白胨，其他成分比例不变。

1.3 试验方法

1.3.1 不同培养基液体发酵培养试验

将试管菌种接种到基础培养基（500 L锥形瓶，装入液体培养基200 mL）中，25℃摇瓶培养3 d后，作为种子培养基，按5%接种量，分别接入试验培养基中（500 L锥形瓶，装液量200 mL），相同条件下培养3 d。

1.3.2 培养基正交优化试验

根据1.3.1试验结果，按照来源广泛、物美价廉的原则，选择黄豆粉、酵母泥、葡萄糖进行三因素、三水平的正交优化试验。

1.4 测定方法

1.4.1 发酵液pH

pH检测采用玻璃电极检测。

1.4.2 菌丝球个数的统计

用剪掉尖头的5 mL移液枪，吸取发酵完成（72 h）的灵芝发酵液10 mL，转移到培养皿中计数。

1.4.3 菌丝体生物量

离心（3000×g，20 min）后，50℃烘干沉淀，减去对照值后计算。

1.4.4 灵芝多糖的提取与得率计算

灵芝多糖提取采用热水浸提，喷雾干燥后测定得率。取干燥的灵芝菌丝体100 g，加1000 mL水，煮沸后维持1 h，离心（3000×g，20 min）去掉沉淀后，上清液喷雾干燥（进风口175℃、出风口80℃、处理速度240 mL/h）。

1.5 数据处理与分析

生长指标相关性分析、正交试验设计、单因素显著性分析等，均用SPSS完成。

2 结果与分析

2.1 供试培养基灵芝液体培养结果

从灵芝液体深层发酵的生产指数来看，发酵液pH的下降是灵芝菌丝开始迅速生长的重要指标之一，但是，pH的下降以及发酵结束的pH与灵芝多糖的得率之间的相关性不强。从表1中可以看出，pH下降速度最快的分别是麸皮、玉米粉，但是麸皮培养基的灵芝多糖得率低于基础培养基（77%，按照基础培养基为100%，下同），玉米粉培养基的灵芝多糖得率略高于基础培养基（108%）。郭天龙采用米糠、麸皮作为主要原料液体培养灵芝，获得10.37 g/L的菌丝体生物量，4.279 g/L、7.644 g/L的胞内和胞外灵芝多糖[5]。试验多糖得率较低，可能与发酵液pH下降太快有关系。程秀芳等对六株来源于不同地区的灵芝菌株同条件液体发酵，确定了pH3.5～4.5，镜检菌丝出现少量自溶点时作为发酵终点，此时灵芝胞内多糖含量最高[10]。

试验发酵结束后，不同培养基的最终pH在4.39～5.23，灵芝多糖得率较高的黄豆粉（145%）、酵母泥（123%）培养基的最终pH均在4.8左右。张晓云采用酵母浸粉为主要原料培养龙芝一号，获得了6.28 g/L的菌丝体生物量和1.68 g/L的胞内灵芝多糖[7]。陈功明选择了酵母粉作为主要培养基，培养赤芝，获得了11.26 g/L的菌丝体生物量和1.63 g/L的胞内灵芝多糖[5]。从表1中可以看出，试验采用酵母泥作为主要培养基成分时，获得了9.04 g/L的菌丝体生物量，以及1.89 g/L的灵芝多糖，与上述文献报道具有一定的吻合度，说明酵母泥是灵芝深层发酵的优选培养基之一。

从表1的数据可以看出，试验最佳的培养基为黄豆粉，同样培养条件下，获得了13.09 g/L的菌丝体生物量和2.24 g/L灵芝多糖。

2.2 灵芝菌丝生长性状与多糖得率相关性分析

结合表1的数据以及相关报道[8]，可以看出灵芝发酵过程中，菌丝球的个数与灵芝菌丝体生物量、灵芝多糖得率具有较好的相关性。乔双逵等观察分析了灵芝深层发酵时，菌丝球的大小及个数与菌丝体产量、灵芝多糖得率关系，结论是中小型菌球比例较高时有利于胞外多糖的合成，并且小型菌球比例大于大型菌球时，发酵液中多糖含量较高[12]。

由图1、表2可见，菌丝球个数、菌丝体生物量、灵芝多糖得率三者之间均具有较好的正向相关性。以灵芝多糖得率为评价标准，则菌丝体生物量与灵芝多糖得率具有极显著的相关性（0.829）、而菌丝球个数与灵芝多糖得率也具有显著的相关性（0.789），皮尔森（Person）双尾检验标准为（P＜0.01）。

图1 灵芝菌丝生长性状与多糖得率相关性分析散点图

表1 供试培养基灵芝液体培养结果

表2 灵芝菌丝生长性状与多糖得率相关性分析

2.3 正交法优化培养基配方

根据前期试验结果，去掉培养基中的蛋白胨成分，选择黄豆粉、酵母泥、葡萄糖作为灵芝深层发酵的主要培养基，同时参照1.3.1“基础培养基”添加相应的无机盐，利用SPSS进行培养基正交优化设计。因素水平见表3。

表3 正交试验的因素水平

按照表4的正交方案进行试验，记录灵芝多糖的得率。极差分析方法结论是，灵芝发酵培养基中，对灵芝多糖产量的影响因素次序是黄豆粉＞葡萄糖＞酵母泥，最优培养基组合为A3B1C3，即：黄豆粉15 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖20 g/L，添加 KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH为6.0左右。

表4 正交试验结果

参照上述配方，按照1.3.1所述条件摇瓶培养灵芝，最终的灵芝多糖得率为4.99%，略低于表4中试验4，可能跟试验操作的误差有关。

表5的统计分析结果与表4的极差分析结果基本相同，其中，黄豆粉用量的显著性为0.007，符合P＜0.05的标准，即黄豆粉用量对灵芝多糖的产量具有显著性影响；而葡萄糖、酵母泥用量的显著性检验值均高于0.05，即这两种培养基对于灵芝多糖的最终得率不具有显著性影响。

表5 主旨间效果检定（响应值：灵芝多糖得率/%）

综上所述，结合经济性的原则，在尽量减少培养基用量的情况下，获得最大的产出，试验最终确定的培养基配方为表4的第4个试验设计，即黄豆粉10 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

依照上述配方，利用100 L发酵罐进行验证试验（26℃、发酵72 h），最终收获灵芝多糖130 g，固体投料量为2650 g，折合灵芝多糖得率为4.9%。

3 小结

灵芝液体发酵过程中，发酵液pH的降低是灵芝菌丝开始迅速生长的标志，但是pH的变化与灵芝多糖的得率没有相关性。灵芝菌丝球个数与菌丝体生物量与灵芝多糖的得率有着显著的正相关性（0.789，0.829），说明提高灵芝液体发酵过程中菌丝球数量可以提高灵芝多糖的得率。

黄豆粉、酵母泥都是灵芝液体培养获取多糖良好培养基；试验中采用的中药渣对于灵芝菌丝的生长均有一定的抑制效果，发酵效果不理想。

经过正交优化，得到的最优培养基配方为：黄豆粉 10 g/L，酵母泥 5 g/L，葡萄糖 10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。100 L发酵罐进行验证试验（26℃、发酵72 h），最终收获灵芝多糖喷雾干燥粉130 g（得率4.9%）。