多学科交叉的药用植物组织培养课程理论教学

邢世海，柳莺莺，曹梦阳，苏兴隆，吴家文，彭代银*

(1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院 中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽中医药大学 人文与国际教育交流学院，安徽 合肥 230012)

植物是能合成初生和次生代谢产物的生物工厂[1-2]，药用植物大多具有丰富的次生代谢成分[3]，某些药用植物还能合成特异代谢产物，从而产生巨大的药用价值，如黄花蒿特异地合成青蒿素[4]，红豆杉树皮特异合成紫杉醇[5]，长春花地上部分合成长春碱和长春新碱等[6]。然而，不少药用植物难以育出种子、种子易休眠或缺少胚乳[7-9]等导致种子的有性繁殖方式存在障碍，而通过无性繁殖方式育苗，特别是组织培养技术培育药用植物具有一定的优越性。

《药用植物组织培养》是一门以现代生命科学知识为基础，结合化学学科的相关科学原理，采用先进的生物技术手段，以药用植物为研究对象，进行组织与器官的发生、培养和细胞融合、遗传转化及生产次生代谢物和中药材工厂化育苗的一门综合的、新兴的、交叉的应用学科[10]。药用植物组织培养在药用植物种苗培育上的重要性，使该课程成为中药学、中药资源开发利用专业本科生的一门应用型专业课。

药用植物组织培养的多学科交叉性，要求该课程教学过程中需结合多学科知识教学，指导学生掌握以下内容：①药用植物本身的内在生理特征，生长与发育规律，形态特征与解剖结构；②药用植物室外栽培的基本原理与基本技术、栽植管理与病虫害防治方法，外界环境对药用植物生长发育的影响等知识；③植物次生代谢物生物合成相关的植物化学知识；④植物分子生物学和基因工程技术相关知识；⑤种子、种苗学的繁殖技术，苗圃的规划、设计相关知识；⑥生物统计学、实验设计相关原理知识。鉴此，为深化药用植物组织培养多学科交叉教学理论研究，促进高校药用植物组织培养多交叉学科的实践展开，本文从教学角度对药用植物组织培养的相关学科交叉教学内容进行探讨。

1 药用植物组织培养教学与植物生理学内容紧密结合

植物生长需要合适的营养条件、适宜的水分条件和偏酸性的环境，这些在植物生理学上称为矿质营养[11]，药用植物所需营养成分根据浓度大小分为大量元素和微量元素，室外生长的植物营养成分和水分可由根系从土壤中获得，植物缺少了某些成分会出现独特的营养缺素症现象[12]，药用植物组织培养时，由于外植体离体培养，所有这些成分必须来自于培养基，培养基组成和配制的教学中结合植物生理学的矿质营养相关内容利于学生理解并把握基本培养基特别是MS培养基的成分组成和浓度水平。

植物能合成生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯、脱落酸、油菜素内酯、独脚金内酯等植物激素[11,13-16]，植物激素对植物的生长发育起着重要的调控作用，而离体植物材料即组培的外植体含有极其微量的内源激素且不能再生，组培时需加入外源激素或合成的类似结构且有相近活性的生长调节剂，来调控外植体的定向诱导。我校中药学专业本科课程设置中未开设植物生理课程，植物激素和生长调节剂又是植物组培定向诱导的指挥棒，所以将植物激素相关内容融入到药用植物组织培养的教学中显得尤为重要；生长素与细胞分裂素的比例在诱导外植体成芽还是成根时起决定性的调控作用，掌握这一规律在实际组织培养中可以通过调节比例控制外植体向芽或向根诱导的定向分化；2,4-D在诱导植物愈伤组织中起极其重要的作用[17]，把握这个知识点，在诱导愈伤组织时加入合适浓度的2,4-D能更好地诱导出愈伤组织；在植物激素和植物生长调节剂中，同一类成分的不同种类对外植体的诱导作用的强弱不同，作用的时间周期也不同，这些植物生理学相关知识利于学生根据实际需要选择合适的植物激素或生长调节剂及其浓度水平。

环境因素对生物生长发育具有一定的影响作用，这在植物生理学中称之为植物生长生理[11]，对植物生长机理的理解能全面地考虑各种因素对药用组织培养植物材料的影响，在实际组织培养中对于温度、水分、氧气和光照等外在环境条件的设置会更为科学、合理；植物具有不同光周期，这部分内容能指导在组培中根据不同植物及其不同的生长、发育时期设置不同的光、暗周期。

可见，无论是培养基的成分、激素筛选及配比、外植体的定向诱导、培养条件的控制等方面都需要植物生理学相关知识，所以在这部分的教学中将植物生理学知识与组织培养技术相结合，能起到更好的教学效果，保证教学质量。

2 结合植物栽培学知识的药用植物组织培养教学

在工厂化育苗生产中，药用植物试管苗需要从温室移栽到大田中，这个过程中植物生存的环境发生很大的变化，需要对试管苗进行驯化移栽，室内的试管苗移植到室外成为大田中生长的种苗需要一个渐进的适应过程。药用植物栽培学较为系统地介绍了植物生长发育与环境条件之间的关系，其中包括环境条件及其本身的互作、温度和光照对植物生长发育的影响、植物的生长发育与水分的关系、土壤及其微生物与植物生长发育之间的关系、植物之间的关系等[18]。了解并掌握这些知识，在药用植物组培苗驯化移栽中，采取正确的处理措施，将药用植物组培苗科学合理地进行大田种植；也能更好地区别异地引种驯化与药用植物组培苗的驯化移栽过程，了解并掌握它们之间的异同点。

3 药用植物组织培养教学与药用植物学知识相结合

药用植物组织培养是建立在植物细胞全能性学说的基础之上，以药用植物为对象，在离体条件下利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原生质体等进行无菌培养，使之再生细胞或长成完整植株的一门技术[10]。因此，在选择外植体时对植物的组织类型、器官种类需充分地熟悉与了解[19]，对它们的生长及生理状态能很好地把握，方能选出组织培养的适宜外植体；理论上任何组织、器官，无论处于什么状态都可以作为外植体进行培养，但实际上很多组织、器官一旦达到或超过称之为过渡态的生长发育时期就很难再脱分化，进而再分化了。在细胞培养中要对植物细胞的基本结构、细胞壁的组成充分了解，便于学习机械法和酶法获得细胞的内容，分离单细胞时的酶处理过程将会更加熟练。在药用植物组织培养教学的各论中，包括胚乳、子房和胚珠培养；花粉和花药培养、原生质体培养和茎尖脱毒等内容，学生需要掌握植物花粉与花药的形成相关知识，掌握子房、胚珠和胚乳的发育过程等基础理论，才能更好地在植物活体上切割外植体，更好地理解胚乳培养为何可以获得三倍体和花药培养获得单倍体植株。

4 药用植物组织培养教学需结合分子生物学和基因工程相关知识

药用植物组织培养与药用植物的基因工程、遗传转化密切关联，其中农杆菌介导的遗传转化方式大多必须借助于组织培养技术，特别是侵染了携带目的基因载体农杆菌的细胞培养和愈伤组织诱导，诱导的愈伤组织再生植株，这些环节都需要借助组织培养技术。同时分子生物学和基因工程的知识也能让学生更好地理解植物组织培养：①不同部位的外植体具有不同的再生能力，可以从基因表达的时空、组织特异性[20]让学生了解虽然同一植物体上的基因组是完全一致的，但因为转录及其调控的时空和组织特异性导致它们的生长发育时期和生理状态存在差异，在这部分还可以把分子生物学的启动子知识，特别是组织特异性启动子[21]介绍给学生。②植物激素的调控作用，将激素受体及其信号转导以及其级联放大反应等相关知识传授给学生，同时植物激素本身或其级联放大产生的信号可能会作为顺式作用元件，这些顺式作用元件通过与相应启动子的结合或分离，从而调控相关基因的表达，达到激素刺激植物生长发育的目的，这些知识点有助于学生更好地理解植物激素和植物生长调节剂在组织培养中具有强大的定向诱导功能。③在讲解植物传粉受精过程中的生殖隔离时，花粉与柱头相互识别的识别蛋白知识利于学生理解。④在药用植物的细胞遗传转化的教学过程中将植物基因克隆、载体构建、遗传转化、转化后经组织培养再生植株以及这些植物材料的分子检测相关基因工程技术穿插到教学中，既扩大了学生的知识面，激起学习兴趣，也能让学生更好地掌握植物细胞遗传转化的内容。⑤在原生质体培养、细胞融合等获得体细胞杂种时，对体细胞杂种的鉴定，将分子鉴定引进来，既丰富了教学内容，又让学生掌握了相关的研究方法。

5 与植物化学相关知识相结合

药用植物含大量的次生代谢物，主要包括：萜类、酚类和生物碱等化合物[3]。这些代谢物在生物体内的合成机制与调控方式既涉及植物生理学知识也涉及分子生物学基因的转录与蛋白的合成调控机制[22]，同时涉及植物化学知识。药用植物次生代谢物可以通过植物组织培养方式来生产，特别是珍稀濒危且具有高药用价值的特异性代谢产物，如采用天然植物材料，利用植物化学方法提取纯化代谢物，材料来源非常有限。此时，可以利用组培产生的愈伤组织、大规模发酵培养的细胞作为材料，提取次生代谢成分，既克服了材料来源的问题又可保护这些濒危药用植物资源不被破坏。因此，在药用植物组织培养关于次生代谢物生产部分的教学中，将植物化学相关知识，特别是提取、纯化知识与工艺向学生做相应的介绍与补充尤为重要。植物组织培养形成的愈伤组织和再生植株的次生代谢物组成与含量往往与天然的中药植物体本身体内成分往往也存在一定的差异[23]。

6 药用植物组织培养教学需结合种子种苗学

药用植物组织培养一个重要的应用就是通过丛生芽再生的方式快速繁殖苗木[10]。愈伤组织经由胚状体或器官发生再生丛生芽，再将丛生芽分植诱导生根，最后形成再生芽和根之间由维管束相连的植株，从而获得组培苗，丛生芽诱导率直接影响着快繁的速度[10]。药用植物组织培养诱导的胚状体可作为人工种子的胚，再加入营养成分、附加成分，包被上人工种皮如海藻酸钠等材料，就可制作成人工种子[24]。药用植物的组培苗或人工种子的种植利用，需有种子种苗相关的知识背景，所以将苗圃规划设计、种子种苗的繁育[25]等相关知识穿插到组织培养快速繁殖和人工种子相应章节会产生更好的教学效果，便于未来从事药用苗圃建设相关工作的同学有一个良好的知识背景。

7 药用植物组织培养教学需结合实验设计与生物统计学

药用植物组织培养是实践很强的一门学科[10]，在植物培养过程中，需从不同的外植体种类，消毒试剂的种类、浓度和消毒时间，基本培养基种类，激素种类和浓度及不同激素组合等方面考虑；还需考虑培养方式，包括：通过愈伤组织再生器官(芽或根)或胚状体然后形成植株，还是器官发生方式等方面，综合考虑这些因素才能筛选出最佳培养方案。这需要学生有实验设计和生物统计方面的相关知识，掌握大样本和小样本的量、全实施或部分实施实验等知识，才能合理设计实验和实施科学的样本量，得出令人信服的结果。如实验中需考虑上述的多因素，不同因素设置多个水平，这类实验如果采用全实施方式，工作量极其巨大，如采用部分实施的正交实验设计[26]，可大大减少工作量和节省实际开支。为此，需将正交实验设计的实验设计思路、如何设计、怎样选择正交表相关知识讲解清楚，同时将正交实验的数据分析方法与该部分教学内容相结合讲解；还需考虑各因素间是否存在交互作用，若存在交互作用需选择交互作用的正交表来安排实验，此时需根据交互作用的自由度安排实验列，从而应用与无交互作用不同的正交表，导致实验的安排不一样[27]。由于正交实验可以适当节省工作量，在应用正交实验设计筛选最佳培养方案时，可将各方面因素全面考虑进来。使用正交实验全面研究各因素对药用植物组织培养的影响，既可促进学生更好地理解植物生长所需要的营养条件和形态建成的激素条件，也利于学生以后进行植物组织培养研究时能更好地设计实验和分析数据。

在教学过程中，以“正交实验设计及其数据分析在药用植物的组织培养中的应用”为专题，进行一个正交实验设计的实例来进行实验安排设计和结果的统计分析专题教学，将药用植物组织培养的最佳外植体、最佳激素组合、最佳筛选方法，不同阶段包括启动培养、生根培养和生芽培养等要求的最佳配方中的影响因子作为因素，设置水平，进行正交实验筛选。通过专题教学，以组织培养作为论文课题的毕业设计的学生能更好地安排实验。其实，植物组织培养的基本培养基如MS、WPM、N5、B6等，对于不同的培养材料、培养阶段有时需对大量元素、微量元素和有机成分等的含量和组成进行微调，以获得具体外植体材料具体培养方式的最佳基本培养基，优化过程可采用正交实验来完成。

综上所述，在药用植物组织培养教学中采用多学科内容相结合教学，使学生既掌握了组织培养的基本原理和基本技术，也能更深层次、更好地理解与把握这门技术及其应用。同时，药用植物组织培养在工厂化育苗、人工种子培育、大规模细胞发酵培养生产次生代谢物时还需要考虑成本预算，也需要了解经济学相关知识。所以在药用植物组织培养相关章节教学过程中与学生互动，根据学生的背景知识复习或全面讲解相关学生欠缺的知识点，能起到更好的效果。