蜂王浆中的Royalactin具有维持胚胎干细胞多能性和自我更新的作用

钱家乐 胡福良│编译

浙江大学动物科学学院，杭州 310058

蜂王浆是哺育工蜂的咽下腺和上颚腺分泌的、用以饲喂蜂王和小幼虫的浆状物质。蜂王浆的化学组成复杂，生物学活性丰富而显著，通常认为蜂王浆中的脂肪酸和王浆主蛋白是蜂王浆的主要活性成分。1992年，Hanes和Simuth首先发现蜂王浆中一种相对分子量为57kDa的蛋白质，将其命名为“王浆主蛋白”（MRJP）。至今，已经从意蜂王浆蛋白中提取分离出9种王浆主蛋白（MRJP1～MRJP9）。2001年，日本学者Masaki Kamakura等研究发现，小鼠肝细胞在王浆主蛋白1（MRJP1）影响下能保留不断生长刺激和细胞增殖表型，于是又将MRJP1命名为Royalactin。虽然这些研究表明蜂王浆中的蛋白质对调节细胞状态和命运有非常重要的功能性作用，但其作用机理尚不清楚。2018年12月4日，《Nature Communications》在线发表了美国斯坦福大学Kevin C. Wang团队的研究结果，表明Royalactin具有维持胚胎干细胞多能性和自我更新的作用。有机体在Royalactin的帮助下能产生更多的干细胞来构建和修复自身，也就是说，它能使干细胞处于一种自我更新的状态。

小鼠胚胎干细胞（mESCs）是从早期胚胎的内细胞团（ICM）或单卵裂球中分离培养得到的一类细胞，其主要特点是一方面有自我更新能力，另一方面具有分化成机体内所有其他细胞的潜能。虽然目前对于控制小鼠胚胎干细胞自我更新的各种信号通路的解析仍在继续，但在体外培养条件下维持干细胞自我更新或促进其分化的方法已经十分成熟。在体外培养中，白细胞抑制因子（LIF）能与胚胎干细胞表面的一复合受体（低亲和性的LIF受体和普通亚基gp130构成异源二聚体）结合并激活Jak酶，通过对STAT3的磷酸化激活维持细胞自我更新基因的表达。另有研究表明，在添加有LIF的无血清培养基中加入2种针对MAPK/ERK激酶（Mek）和糖原合成酶激酶3（GSK3）的小分子抑制剂（2i），能够有效降低多能性因子的异质性表达，从而使胚胎干细胞处于类似内细胞团的自然基础状态，能在更加稳定的状态维持其多能性和自我更新。然而，长期抑制Mek1/2的表达可能对小鼠胚胎干细胞的表观遗传和遗传完整性有不利影响，并会明显限制其发育潜能。由此，如何用新的方法进行体外培养胚胎干细胞并维持其处于内细胞团基态成为目前亟待解决的问题。

斯坦福大学Wang团队证实了蜂王浆中的Royalactin可以在无LIF的情况下通过调节染色质的可及性来激活体外小鼠胚胎干细胞的多能基因网络，并维持其自我更新。在Royalactin条件下培养的细胞也能维持在一个更加原始的状态，并通过种系传递有能力产生嵌合体动物。同时，还证实了一种哺乳动物体内存在Royalactin的结构类似物也具有相似的功能，揭示了特定进化过程中的分子保守现象。其研究内容和结果主要包括以下4个方面：

一、Royalactin能有效维持mESCs的自我更新和多能性

Wang团队以小鼠及其胚胎干细胞作为实验对象，并主要通过小鼠胚胎干细胞模型研究Royalactin在哺乳动物中的作用机制。实验首先通过将2种不同的mESCs（J1、R1）分别放在3种不同的培养基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）培养10代、20代。结果表明，长期处于血清/+LIF培养基条件的mESCs经过培养后仍保持自我更新的形态，而在血清/-LIF培养基中培养的mESCs表现出分化后的形态。令人惊讶的是，在血清/-LIF+Royalactin培养基条件下培养的mESCs经过多代培养仍能在一定程度维持未分化的状态，并且mESCs中未分化细胞的数量与培养基中Royalactin的剂量在一定范围内呈正相关。细胞的基因表达谱也证实了在血清/-LIF+Royalactin和血清/+LIF培养下的细胞表现出高度的相似性。

在观察到Royalactin在体外对mESCs有很好的干性维持效应后，他们接着对血清/-LIF+Royalactin条件培养下的mESCs能否在体内仍能维持胚胎特征和分化潜能进行了检测。他们对该细胞进行皮下移植后培养6周，成功观察到畸胎瘤的产生。上述研究结果表明，Royalactin能有效维持mESCs的自我更新和多能性。

二、Royalactin能调节染色质和多能网络

Royalactin对mESCs转录组有怎样的影响呢？Wang团队对3种培养基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）中培养的mESCs进行了RNA-seq分析。结果表明，Royalactin条件下和LIF条件下的mESCs在标准多能基因的高度富集和系列特异性基因的抑制表达在多个水平都较为相似。由于Royalactin影响下的mESCs中有基因富集的情况，他们对该条件下的所有差异性表达的基因进行了GO term分析，结果表明Royalactin对mESCs的基因富集主要涉及细胞增殖和维持细胞干性等基因表达的上调。同样地，他们分别对3种培养基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）培养的mESCs进行了ATAC-seq分析，结果表明Royalactin与LIF条件下mESCs的ATAC-seq信号增幅相对于血清/-LIF条件更为相似，尤其是在启动子、增强子和超级增强子水平。上述的RNA-seq与ATAC-seq的实验结果高度相关，并且GO分析的功能注释表明ATAC-seq主要落点于与多能性、代谢和分化相关基因。此外，motif富集分析显示，Royalactin影响下的超级增强子组分上调引起了KLF5、KLF4和SOX2等转录因子与其结合位点的高频结合。总的来说，这表明了调控序列对Royalactin条件敏感，并能因此调控下游基因的表达。

为了加深在分子水平对Royalactin条件下的小鼠胚胎干细胞基因表达模式的认识以及找寻可能的多能性调控因子，Wang团队对Royalactin条件下的mESCs进行了转录组网络分析，结果表明Stat3、Tfcp2l1、Esrrb以及Nanog等转录因子在转录网络中是最重要的节点。后续的实验表明，Royalactin对磷酸化Stat3以及其他多能因子的刺激有一定程度的剂量效应。另外，减少这些转录因子会极大程度地限制Royalactin对mESCs的作用。这一系列的发现说明了Royalactin能激活一条非LIF依赖性的信号通路，并且该通路能激活Stat3转录因子。对血清/+LIF和血清/-LIF+Royalactin条件下培养的mESCs进行基因表达谱分析显示，有519个基因仅受Royalactin影响并上调。对这519个基因进行GO分析，结果表明这些基因主要富集于代谢和生物合成过程，这让他们联想到2种针对MAPK/ERK激酶（Mek）和糖原合成酶激酶3（GSK3）的小分子抑制剂（2i）存在条件下的无血清有LIF的2i培养基。于是他们对血清/-LIF+Royalactin、2i和血清/+LIF培养基条件下培养的mESCs分别进行了全基因表达谱分析和主成分分析。结果表明，相对于血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin和2i条件下培养的mESCs聚类情况更为明显。总之，上述结果表明Royalactin会维持mESCs的多能性，并以此猜测Royalactin可能会使mESCs处于自然基础状态。

三、Royalactin促使mESCs的多能性处于类自然基础状态

根据之前的猜想，Wang团队对Royalactin是否能使mESCs的多能性处于自然基础状态进行了验证。首先通过简单的对照实验证实了在2i+LIF和0i+Royalactin培养基中的mESCs的多能性保存效果良好，而0i培养基中的mESCs有明显的分化现象。另外，将0i+Royalactin培养基培养的细胞注射进小鼠的囊胚中，产生的嵌合体后代性状能进行种系传递，说明Royalactin在生物体内的影响是不损害其健康的。

RNA-seq和GO分析进一步说明了2i+LIF和0i+Royalactin培养基培养的mESCs所富集的基因有显著相似性，对2i+LIF、0i+Royalactin、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin和血清/-LIF培养基培养的mESCs进行全基因谱分析和主成分分析，结果证实了0i+Royalactin和2i+LIF条件下的细胞相比其他条件下的细胞聚类情况更加明显。对上述条件下培养的细胞进行GO富集分析，发现在基础代谢、转录过程以及发育等过程呈现差异。以上数据表明，Royalactin对mESCs的影响伴随着深刻的代谢重编程，并且类似于2i+LIF条件，Royalactin能促使mESCs模拟小鼠内细胞团细胞环境，使其多能性处于类自然基础状态。

四、在哺乳动物体内找到Royalactin的类似物

Wang团队想知道哺乳动物体内是否存在Royalactin的类似物。通过使用高灵敏的蛋白序列比对方法PSI-BLAST和HHPRED进行数据库搜索并根据序列和结构比对人类和小鼠蛋白质。虽然在上述数据库没有找到Royalactin的直接同源蛋白，但HHpred在PDB数据库中找到了Royalactin的“远亲”——一种沙蝇的唾液腺分泌的蛋白质（SGP）。于是他们以SGP作为模板，在同源建模软件MODELLER中模拟Royalactin的折叠模式，构建了一个高可信度的模型，想凭借此模型重新用更为精准的HHpred在人蛋白质组中搜索，以期找寻该模型的结构功能类似物。最终他们找到唯一与模型相匹配的蛋白质，并将其临时命名为NHL Repeat Containing 3（NHLRC3）。虽然之前对NHLRC3的功能并没有过任何报道，但他们通过对小鼠胚胎进行单细胞RNA-seq分析，发现在4.5日龄胚胎中NHLRC3开始表达，并在此后逐渐提升其表达量。为证明它与Royalactin有相似的对mESCs的多能性有维持作用，他们将重组后的NHLRC3加入到血清/-LIF培养基中，制成血清/-LIF+NHLRC3（0i+NHLRC3）培养基。经过多代培养后，Royalactin和NHLRC3影响下的mESCs都处于未分化状态。另外，将0i+NHLRC3条件下培养的小鼠胚胎干细胞注射进小鼠囊胚中，并将囊胚发育成能进行种系传递的嵌合体动物，说明NHLRC3在生物体内的影响是不损害其健康的。因此，NHLRC3被证实为哺乳动物多能性维持因子，它的存在也说明了大分子结构和功能的显著保守性。由于其和Royalactin有相似的功能，并且在一定程度上可以说是蜂王浆成就了蜂王，因此他们将NHLRC3重新命名为Regina（拉丁语的女王）。

综上，经过一系列的实验探究，Wang团队证实了Royalactin能维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和多能性，并且可以促使其处于自然基础状态；在哺乳动物体内还找到了Royalactin的类似物Regina，同时也证实了Regina作为多能性因子也能促使小鼠胚胎干细胞处于自然基础状态。对于Royalactin和Regina在基因通路和进化中保守的生化过程之间交互作用的深刻认识，和不同的多能网络功能是怎样单独或协同维持干细胞自我更新，将会使人类能更好地控制干细胞的命运，并能提供一个进一步研究多能状态的平台。对Regina的发现和探究也因此支持了一个有趣的观点：即使是进化程度极高的特殊性状也有着极深刻的分子保守性。对于Royalactin和Regina在哺乳动物细胞中机械性作用的深刻探究，将会对哺乳动物多能性有更深刻的理解。此外，Royalactin和Regina可以为因细胞死亡引起的疾病（如阿尔茨海默病、心脏衰竭和肌肉萎缩等）带来新疗法，在医学应用领域有着更加深远的意义。