医学院校研究生开设转基因动物技术课程的意义和教学体会

杜小燕, 陈柏安, 仵 毅, 郭 萌

(首都医科大学实验动物部, 北京 100069)

随着科学技术的发展，转基因技术在全球飞速进步，尤其是转基因动物在医学和生物学领域取得巨大成就并得到广泛应用。转基因动物是利用转基因技术改造动物性状后获得的一类珍贵的动物资源，通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物[1]。自从1980年Gorden完善了显微注射技术[2]和1982年第一只超级小鼠问世以来[3]，转基因动物(基因修饰动物)作为人类疾病动物模型开始进入了医学研究领域，转基因(基因修饰)动物及技术在医学领域的作用越来越显著，应用也越来越广泛，新型基因编辑技术CRISPR/Cas9更被看作下一个诺贝尔奖的热门[4,5]。因此，让医学院校的研究生了解和掌握转基因动物领域的前沿技术和发展动态，初步掌握转基因动物的制作方法与技能，将会为其以后的研究工作增加理论和技术储备。首都医科大学实验动物部面向全校(包括校本部和临床医院)开设了转基因动物技术这门课程，上课后学生的反响非常好，在此分享开设该课程的体会。

1 针对医学研究生开设转基因动物技术课程的意义

转基因(基因修饰)动物自诞生伊始就和医学紧密相连，可以说医学研究离不开转基因动物技术。从转基因技术诞生到现在历经30多年，经过不断发展和完善，尤其CRISPR/Cas9技术出现后表现得非常经济和高效，越来越多的生物医学实验室拥有了自己的转基因动物制备平台。

目前世界各地研发的基因工程品系仅小鼠和大鼠已接近20 000种[6]。在PubMed中查询表明，利用基因修饰小鼠进行研究的论文达41万多篇。我们统计了自1983年超级小鼠问世以来含有Knockout mouse和Transgenic mouse的论文，显示论文数量与发表时间具有正相关性(图1)，但从2016年开始有下降趋势，其原因可能是CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术突破了基因敲除局限于小鼠胚胎干细胞操作的瓶颈，除小鼠以外的其他动物包括大型实验动物的基因修饰研究日新月异，从图2我们可以看出，大鼠、兔、猪、非人灵长类等实验动物的研究论文在PubMed中合计达到23 441篇，这些数据显示基因修饰动物在科学研究的影响力之大和使用范围之广，也充分说明CRISPR/Cas9技术使更多类型的动物基因敲除成为可能，近5年更是有了突飞猛进的发展。

在医学研究中, 转基因动物技术的意义体现在以下两个方面。首先, 在疾病治疗方面，利用转基因动物技术研究基因治疗是重要突破点。1980年代初，科学家首次利用原核显微注射技术成功将生长激素基因转入小鼠，获得了个体几乎可以和大鼠“媲美”的超级小鼠，预示有了治疗人类侏儒症的希望，也由此为基因治疗带来了生机，科学家们开始了基因治疗的探索。最近，科学家们用CRISPR/Cas9 技术制备的质粒结合人造病毒来研究用基因敲除技术治疗肝癌[7]; 人们正在试图用基因修饰的猪胰岛进行异源性移植来治疗糖尿病的可行性[8]; 科学家利用CRISPR/Cas9技术编辑β-球蛋白来治疗镰刀血病[9]。第二，多种重大疾病的发病机制、靶点筛选和药物评价等研究离不开转基因动物模型。例如: 感染性疾病艾滋病、乙型肝炎等, 退行性神经疾病阿尔茨海默症、亨廷顿氏病等, 多种类型肿瘤，精神病抑郁症等，通过转基因技术，科学家们已制备出越来越多种能够较好复制人类疾病的动物模型和人源化动物模型, 如将1.3个拷贝的乙型肝炎病毒插入到小鼠基因组，使动物肝脏表达病毒, 获得小鼠乙型肝炎模型[10]。将人类突变的亨廷顿基因转入非人灵长类获得了亨廷顿氏病动物，模型具有人类亨廷顿氏病的典型临床表型[11]。最近我国科学家又将自闭症相关基因MECP2转入猴基因组，建立了第一种转基因猴自闭症模型，转基因猴具有人类自闭症的临床表现[12]。其他例如将人类PD-1、CTLA4等基因通过同源重组方法取代小鼠基因获得的人源化小鼠广泛应用于肿瘤治疗、抗体和免疫调节剂药物筛选及评估的研究，利用APOE敲除小鼠制备的动脉粥样硬化模型，app、ps1、tau等不同突变或联合突变转基因大小鼠阿尔茨海默症模型，多种基因敲除免疫缺陷小鼠等方面的研究更是不胜枚举。由此可见，转基因动物是生物医学研究中不可或缺的有力武器。

图 1 基因敲除小鼠、转基因小鼠和基因修饰小鼠

2 转基因动物技术课程教学体会

图 2 利用除小鼠外的其他主要实验动物在PubMed中发表文章的数量

2.1 教材建设

虽然转基因动物技术课程在首都医科大学开设已有十余年，但一直都采用教师自行收集材料编写成册作为教学材料使用，缺乏面向学生尤其是研究生的教材。2011年我们启动了教材编写工作, 在前任教师们编写手稿的基础上, 参考了Robert F. Weaver的《分子生物学》、卡尔的《转基因动物技术手册》等专著，查阅了近200篇外文文献，增加了大量较新的技术内容, 例如CRISPR/Cas9和TALEN[transcription activator-like (TAL) effector nucleases]等，于2013年命名为《基因修饰小鼠制备常用技术》，完成了医学院校转基因动物技术课程的教材建设。在该教材中，以小鼠为主要对象，系统阐述了基因修饰动物概述、原核注射法制备转基因动物、基因敲除小鼠制备、条件性基因敲除、基因捕获、CRISPR/Cas9和TALEN系统敲除以及基因修饰小鼠繁育和保种等7个章节的内容，这些内容既方便学习和使用基因修饰小鼠的医学生物学研究所及相关科研人员，也基本做到了对国际上最新开发的基因修饰技术方法的兼收并蓄[13]。

2.2 课程大纲和内容设置

在教学大纲中，我们确定的教学目标为“通过本课程的学习，使学生了解和掌握转基因动物领域的前沿技术和发展动态，初步掌握转基因动物的制作方法与技能，为以后的研究工作增加理论和技术储备”。为了实现这样的目的，我们采用“理论授课、实验教学以及视频录像相结合的方法。使用现代教学手段方面的要求：多媒体教学所需设备仪器以及VCD、录像带等”的教学方法。

该课程共28学时，其中理论课10学时，主要介绍转基因动物基本知识、研究进展、应用领域及研究中存在的问题；实验课18学时分5次教学，以显微注射法为例学习和练习转基因小鼠的制备，包括小鼠的超数排卵、假孕鼠的制备、胚胎收集鉴定、外源基因导入、胚胎移植及胚胎冷冻保存等内容。这样的课程设计，能让研究生既学习了转基因动物的概念、命名、原理等基本知识，也扩展了他们的知识面，扩大视野，了解了显微注射方法[2]等传统技术，同时接触到锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技术[14]、TALEN 靶向基因敲除技术[15]、CRISPR/Cas9技术[5]以及这些技术的优势所在[16]。例如在理论课程中，我们介绍TALAN以及CRISPR/Cas9两种技术，讲解原理和制备方法，并检索大量应用这些技术的文献，分析其研究思路。我们还介绍了最新出现的NgAgo(Natronobacterium gregoryiArgonaute) 技术(DNA作为引导工具的基因编辑技术)及与之相关的争议[17]，力图将科研诚信教育和科研新思路相结合。为了让学生有更深刻的印象和丰富实践，我们充分利用动物部实验平台的优势，设计了实验课优势的学时分配方案，在实验中学生能从超数排卵到显微注射法全程进行操作。学生课后都感慨这些操作非常实用和精细，获益匪浅。

2.3 课程考核方法改革

作为研究生选修课的考核，我们摒弃了过去出题考试或者写综述的考试方法，而是利用小班课优势，让每个研究生根据自己的专业，按拟定的研究方向或研究内容等查阅转基因动物应用方面的文献，从文献的研究背景、转基因动物制备思路、转基因动物在整个研究中的作用、研究结果、有哪些缺陷、如何评价其作用等方面借助PPT进行讲述。在设计初始，我们担心这种改革可能对于涉入科研尚浅的研究生会有困难，但最终教学效果出乎意料地好，同学们不但完成了老师的“规定动作”，有的还加入多篇同一转基因动物在该领域的应用研究进行比较。例如一位骨科专业的学生，以1篇文章为切入点，将本领域中对骨密度相关基因研究的转基因动物模型及其应用进行了分析和比较，深入浅出地讲述让同学们听得入迷。这种改革不但帮助学生掌握理论知识，了解本领域新进展，还通过交流激发了对其他方向的浓厚兴趣，为学生与学生、教师与学生之间建立联系和研究交叉提供了非常好的机会。

虽然转基因动物在生命科学中发挥重要作用,基因编辑技术业已成为生命科学研究中的常用技术手段之一, 但是很多医学院校的教师和学生都存在认识误区, 甚至有些临床医学科研人员和研究生认为，转基因动物与自己的科研没有关系。所以尽管上课效果和反响不错, 但我们的课程选修人数却不太多。

因此, 我们建议医学院校首先应扩大宣传，让学生认识到这一技术的重要性。作为将来要从事临床或基础研究的医学院校研究生，其研究生涯中可能涉及转基因动物模型。那么, 医学研究生们能够对不同转基因动物制备方法的原理、优缺点以及进展进行了解和学习, 对转基因动物的命名、繁育、鉴定、保种等知识的了解是非常必要的。第二, 我们还建议在课程中多介绍最新的进展以引起学生的重视和兴趣, 例如在教学中每年更新图1和图2的数据, 以此凸显该课程的重要性。2017年我们在教学中介绍了Nature Communication杂志的最新论文[18],学生表现出极大兴趣。希望更多医学院校能通过本文的阐述了解开设转基因动物课程的意义和教学实践，为研究生开设这门课程。