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姜黄素预处理对沙漠干热中暑大鼠回肠、结肠内容物菌群表达量的影响

2019-01-07李建瑛张东辉李佳佳杨亚萍杨秋月是文辉马娜宋来阳刘江伟

实验动物与比较医学 2018年6期
关键词:乳酸杆菌常温姜黄

许 琴, 董 翔, 李建瑛, 张东辉, 李佳佳, 杨亚萍,杨秋月, 是文辉, 马娜 , 宋来阳, 刘江伟

(1. 新疆军区总医院新疆特殊环境医学重点实验室, 乌鲁木齐 830000;2. 新疆农业大学食品科学与药学学院, 乌鲁木齐 830052)

中暑是指在高温作业环境,由于热平衡或水盐代谢紊乱而引起的以中枢神经和心血管障碍为主要表现的急性疾病,常表现为惊厥、昏迷以及高体温[1]。沙漠干热具有一系列特征,如紫外线强度高,降雨量和水量少,极端干燥和炎热, 使得在沙漠干热环境下工作的人中暑风险更高[2]。相关研究[3]表明,重症中暑是由过高热引起的类脓毒症样急症,其病死率近几年在持续增高。

正常人体肠道内寄居着数量庞大、种类繁多的微生物, 以细菌为主, 统称为肠道菌群, 其细胞总数高达1014、种类大于1 000种, 是人体细胞总和的10倍[4]。肠道内正常菌群对外袭菌的定植抵抗力及菌群的聚集构成了肠道的生物屏障[5],可防止肠道内细菌和内毒素侵入血液循环。近期研究[6]表明,细菌内毒素在中暑发生中起着不可忽视的作用。

姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种物质,也是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分[7]。近年来, 姜黄素的生物学活性受到广泛关注, 其抗肿瘤、抗炎症及器官保护等作用均被发现,目前美国国立肿瘤所已把姜黄素列为第三代抗癌化学药物[8]。

我们推测姜黄素可能在沙漠干热中暑的防治方面具有一定作用,本实验从回肠、结肠内各菌群表达量的变化来观察姜黄素对沙漠干热环境中暑大鼠的预防作用,探讨其在沙漠干热环境中暑防治中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性 SD 大鼠,220~250 g, 购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心[SCXK (新)2012-001]。5只一笼于SPF饲养间IVC笼盒内预饲一周,饲养室温度为 25±0.5 ℃,明暗各12 h循环,大鼠自由采食,供给灭菌酸化水[SYXK(新)2012-003]。

1.1.2 试剂 姜黄素购自日本 TCI公司(C0434), 羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司,戊巴比妥钠购自德国默克公司, GoodViewTM核酸染料、DNA Marker购自大连宝生物工程公司,DNA试剂盒购自Omega Bio-tek公司,PCR引物由北京华大基因生物技术有限公司合成。

1.1.3 主要仪器设备 西北特殊环境人工实验舱为专利产品[9-14]; 多功能生理信号仪420购自成都仪器厂; 台式低温高速离心机购自美国Thermo 公司; 微型低速离心机购自杭州奥盛仪器有限公司; IVC饲养笼盒购自意大利TechPlus公司; 温度梯度PCR仪、核酸电泳仪购自美国Bio-Rad公司; 全能型凝胶成像系统购自美国UVP公司; 超微量微孔板分光光度计购自美国Bio-Tex公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黄素配制和动物分组 53 kHz, 65 ℃超声配制质量分数0.5%羧甲基纤维素钠, 以质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠生理盐水为溶剂,配制质量分数20 mg/mL的姜黄素混悬液。姜黄素一般于灌胃前1 d配制,于每次灌胃前均经53 kHz,37 ℃超声30 min,灌胃时充分混匀。

雄性 SD大鼠50只, 随机分为5组, 每组10只,包括常温常湿空白组、轻度中暑组、中度中暑组、重度中暑组、重度中暑姜黄素干预组(简称姜黄素干预组), 除姜黄素干预组大鼠每日1次以姜黄素20 mg/100 g, 1 mL/100 g体质量, 连续灌胃7 d。其余各组按相同体积连续灌胃生理盐水7 d[15-18]。

1.2.2 中暑模型复制 常温常湿空白组置于SPF饲养间内,(25±0.5) ℃,相对湿度50%±2%,干热组大鼠置于西北特殊环境人工实验舱模拟沙漠干热环境中(41±0.5) ℃,相对湿度10%±2%复制中暑模型,参照实验室前期建立的中暑模型[19,20]。使用多功能生理信号仪420检测大鼠核心体温,即将多功能生理记录仪中的温度探头经液体石蜡浸润后, 由肛门旋转进入大鼠直肠约3 cm处, 待记录仪上温度曲线基本保持平稳后(约30 s),读取记录仪上的温度值,即为此时受试大鼠的核心体温。大鼠分别在干热实验舱内热暴露(50±5) min, 核心体温达到 39.5~40.6℃,暴露(100 ± 5) min, 核心体温达到 40.4~41.2 ℃,暴露(150 ± 5) min, 核心体温达到41.2~42.5 ℃, 造成轻、中、重度中暑模型。受试大鼠给药进舱后, 严格按时间与核心体温进行筛选,因个别给药操作不当,刺激受试动物咽喉或受试动物耐热性个体差异的存在, 淘汰中途死亡及核心体温未达标动物, 保证各组纳入分析的动物数≥6只。各组大鼠出现各中暑阶段的迹象之后,即轻度中暑大鼠身体出汗,但仅局限于头颈部,呼吸频率加快,异常兴奋, 在笼内四处串动; 中度中暑时大鼠呼吸频率更快, 全身出汗并已湿透, 仍然四处串动,但明显动作已经迟缓, 喜欢将头埋于其他动物身下或垫料中; 重度中暑时动物呼吸急促,明显呼出时间长,吸入时间短,气体交换基本是有出无进, 全身出汗湿透,嘴角有唾液等分泌物流出,爬在笼低不动,此时若延长热暴露时间,动物渐渐停止呼吸死去[21]。

1.2.3 实验取材 实验结束后处死大鼠,把大鼠放在无菌手术台,腹面朝上, 四肢分开, 用手术剪在腹部正中部剪开皮肤及肌肉层,注意刀尖稍向上挑以免伤及内脏。找到胃、十二指肠后,顺下找到盲肠,由回盲瓣向胃端上行越10 cm后, 剪取近胃端回肠4 cm,留取其中回肠内容物,液氮冻存; 无菌取近盲端结肠约2 cm, 同法取其中内容物标号登记后,液氮冻存待测。

1.2.4 细菌基因组DNA的提取 液氮冻存的回、结肠内容物采取液氮研磨法,并结合粪便细菌DNA提取试剂盒说明书提取肠道内容物菌群基因组DNA[22],具体操作如下: (1)随机取出样品,无菌组织剪剪取0.1 g肠内容物,放入10 mL带盖离心管中,加入0.2 g经高温干烤的玻璃珠,加入液氮并用粗玻璃棒研磨直至磨碎。(2)待液氮挥发后,按照Omega Bio-tek DNA试剂盒说明书进行操作。(3)将提取的DNA用超微量微孔板分光光度计测DNA浓度,标号登记后,-20℃冰箱保存待用。

1.2.5 引物的设计与合成 设计针对细菌16S rDNA的V3至V5区大肠杆菌、双歧杆菌属、乳酸杆菌属和肠球菌属特异性引物[23-25]。引物设计见表1。引物委托北京华大基因合成。

1.2.6 PCR扩增 以上大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌引物对, 以细菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增。反应体系均为15 μL: 2×Pre-mix 7.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,细菌DNA模板1 μL,灭菌蒸馏水 5.5 μL。

扩增条件: 乳酸杆菌属94 ℃预变性4 min, 94 ℃30 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 60 s, 30 个循环, 72 ℃ 7 min延伸; 双歧杆菌属94 ℃预变性4 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 45 s,35 个循环, 72 ℃ 10 min延伸; 大肠杆菌属94 ℃预变性4 min,94 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,32 个循环,72 ℃ 7 min延伸; 肠球菌属94 ℃预变性3 min, 94 ℃ 30 s, 54.5 ℃40 s,72 ℃ 50 s,30 个循环,72 ℃ 7 min 延伸。

1.2.7 琼脂糖凝胶电泳检测 取PCR产物各10 μL,10 mg/L琼脂糖凝加5 % Goodview染液, 1×TAE缓冲液,120 V稳压电泳25 min左右,凝胶成像系统拍摄电泳图谱, 检查扩增效果,用UVP配套图像分析软件对图像进行灰度分析,计算各菌种的相对表达量。

1.3 统计方法

所得数据以x- ±s表示,实验组和对照组各类细菌相对表达量的比较用 SPSS 22.0版统计软件进行单因素方差分析, 两两比较选用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠回肠内容物菌群表达量的变化

运用凝胶成像系统自带分析软件,对各组大鼠回内容物DNA基因组扩增得到的各菌种扩增目的片段进行灰度分析,得到各菌种的平均吸光度值,以此值来分析各菌种的相对表达量,结果见表2。

由表2可看出,各组大鼠回肠内容物肠球菌的表达量与常温常湿组比较,中度、重度中暑组极显著增加(P<0.01),随中暑程度的加深,回肠肠球菌的表达量急剧增加(P<0.01),而姜黄素干预后,与重度中暑组比较,肠球菌的表达量极显著下降(P<0.01)。大肠杆菌的表达量,与常温常湿组比较,轻度中暑组显著增加(P<0.05),中度、重度中暑组极显著增加(P<0.01),随中暑程度的加深,回肠大肠杆菌的表达量极显著增加(P<0.01),而姜黄素干预后,与重度中暑组比较,大肠杆菌的表达量极显著下降(P<0.01)。双歧杆菌的表达量与常温常湿组比较,轻度中暑组显著降低(P<0.05),中度、重度中暑组及姜黄素干预组均极显著降低(P<0.01), 而姜黄素干预后, 与重度中暑组比较表达量有显著回升,但未达到常温常湿环境组水平。乳酸杆菌的表达量组间比较均未发生明显变化。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequence

表 2 各组大鼠回肠内容物菌群表达量的多重比较Table 2 Multiple statistics comparison on microflora expression of ileum content in different groups

表 3 各组大鼠结肠内容物菌群表达量的多重比较Table 3 Multiple statistics comparison on microflora expression of colon content in different groups

2.2 各组大鼠结肠内容物菌群表达量的变化

由表3可知, 与常温常湿组比较, 各组结肠中肠球菌的表达量显著增加(P<0.05或P<0.01), 姜黄素干预后结肠肠球菌的表达量极显著降低(P<0.01),并基本达到常温常湿环境组水平。大肠杆菌的表达量与常温常湿组比较, 重度中暑组显著增加(P<0.05),姜黄素干预后,与重度中暑组比较,大肠杆菌表达量极显著降低(P<0.01),并接近常温常湿组水平。各组结肠中乳酸杆菌的表达量,轻度、中度、重度中暑组差异不显著,使用姜黄素后没有增加其表达量。各组结肠中双歧杆菌的表达量,轻度、重度中暑极显著降低(P<0.01),而中度中暑时,由于机体的自身代偿,双歧杆菌的表达量极显著增加(P<0.01)。姜黄素干预后,结肠双歧杆菌的表达量极显著增加(P<0.01)。

3 讨论

中暑是因人体在热环境中暴露时间过长(或在烈日下暴晒),而发生的以中枢神经系统和循环系统障碍为主的急性疾病,是热应激症候群的总称。现有研究[26]表明,中暑是热失代偿引起的类脓毒症样反应,炎症因子的大量释放及由此引发的过度免疫是引起机体死亡的原因之一。重症中暑多继发弥散性血管内凝血(DIC),而由此引发多器官功能障碍(MODs)是其主要死亡原因,重症中暑死亡率极高且预后不良,目前国内不时有重症中暑的报道,中暑的预防工作应受到足够重视[27,28]。相关研究[29]表明, 高温应激会引起肠道菌群结构改变, 诸如双歧杆菌和乳酸杆菌等被视为有保护作用的细菌总数下降,而肠球菌和大肠杆菌等有害健康的种群数目增加。本实验据此对不同程度中暑大鼠回肠与结肠内容物菌群表达进行检测,结果显示回肠与结肠内条件致病菌大肠杆菌、肠球菌的表达量显著增加, 正常生理状况下,消化道菌群的数量自口腔至结肠是逐渐增加的,而在重症中暑时则出现了倒置的病理状况,实验进一步为中暑是由过高热引起的类脓毒症样急症提供了实验数据。大鼠长时间暴露于高温干热环境中, 体表水分大量流失,表面静脉血管扩张充盈,血流重新分配,导致内脏处于相对缺血缺氧状态, 肠道对缺血缺氧非常敏感, 大量氧自由基堆积及血管内皮细胞损伤引发DIC,致使肠道黏膜上皮细胞坏死、脱落, 肠道黏膜物理屏障、黏膜免疫屏障、肠道黏膜生物屏障遭到破坏, 加之肠道菌群稳态被打破, 大量条件致病菌增值, 肠道菌群移位,细菌内毒素入血,炎症因子大量释放引发过度免疫, 最终导致脓毒症的发生, 并进展为MODs,导致患者死亡[30]。虽然对重症中暑的险恶及其并发症进行了大量的研究,但对中暑的发病机制并未阐明,对其救治仍然没有找到有效方案,仍需要进行不断研究找到更多防治药物与救治方法。

本实验通过将姜黄素提前灌胃给不同程度中暑的实验大鼠来评价姜黄素对中暑后肠道有益菌和条件致病菌的影响,实验结果显示,姜黄素预处理后能提高回肠与结肠内有益菌双歧杆菌的表达量,又能降低回肠与结肠内条件致病菌大肠杆菌和肠球菌的表达量,而肠道正常菌群在机体消化、免疫和抗病等方面有诸多不可替代的作用,本实验结果进一步表明姜黄素具有调节中暑后机体消化道菌群结构的作用,同时也提示姜黄素可能在减缓中暑大鼠肠道炎症反应方面有一定作用。但中暑后乳酸杆菌表达量没有明显改变,查阅相关文献可知,乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个菌种,它在人和动物体内占绝对优势,以它为表达系统,较其它菌株更易达到较高的表达量[31]。本实验结果提示姜黄素可能对肠道内乳酸杆菌没有干预作用,其机制尚不明确,有待进一步探究。

本实验结果提示,姜黄素可能通过提高中暑大鼠回肠、结肠,尤其是结肠内双歧杆菌的表达量,抑制回肠、结肠内大肠杆菌和肠球菌的增殖来维持中暑大鼠肠道菌群稳态,减少肠道炎症因子对机体的侵袭,发挥对中暑的预防作用,增强大鼠对中暑的耐受力,结肠内双歧杆菌的表达受干热中暑应激的影响波动较大,姜黄素抑制结肠内双歧杆菌表达量的减少,作用效果显著,其具体机制尚需进一步研究。

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