竹节参总皂苷通过激活自噬抑制衰老大鼠心肌细胞凋亡

王烙佩，郑杰，李思敏，张长城，王婷，袁丁，周志勇

（1.三峡大学医学院，湖北宜昌 443002）(2.三峡大学附属仁和医院，湖北宜昌 443001）

心血管疾病已成为全世界第一位致死、致残原因，年龄是心血管疾病发展的重要危险因素，统计显示，50岁以上人群心血管疾病发病率显著升高，其发病形式多样，包括外周血管病变、冠状动脉疾病、心力衰竭、血脂异常和高血压等[1,2]。且大量研究结果表明，衰老心脏呈现独特的组织学和生物化学特征，主要包括心肌细胞坏死增多，核增值、体积变大，结缔组织聚集，心肌细胞凋亡数量增多[3]，心肌纤维化程度加重，并伴有心脏舒张功能降低和心率失常增加等风险[4]。近期研究表明，自噬活性与心肌细胞凋亡密切相关，自噬增强能有效减轻左旋硝基精氨酸诱导高血压所致的心肌损伤，减轻心肌细胞凋亡[5]。且抑制自噬，加剧乌头碱诱导的心肌细胞凋亡[6]。

竹节参系五加科人参属植物竹节参（Panax japonicusC. A. Mey.）的干燥根茎，其主要化学成分为竹节参总皂苷（total saponins ofPanax japonicas，TSPJ），具有补虚强壮，散瘀止血、止痛的功效，多用于素体嬴弱，跌扑损伤，咳嗽咯血以及痰多[7,8]，在我国少数民族土苗聚居地广泛使用，在土家族称为“草药之王”，具有极高的药用价值，近几年成为研究和探索的热点。我们课题组前期研究证实，TSPJ具有良好的心脏保护作用，能有效减轻缺血导致的心肌损伤，恢复心功能，并可显著抑制急性缺血、心梗导致的心肌细胞凋亡[9]。近期研究显示，TSPJ能有效改善衰老大鼠心肌形态，减轻心肌纤维化，抑制H9c2大鼠心肌细胞中促凋亡蛋白 Bax的活性，促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的活性、提高Bcl-2/Bax的比值，有效改善心肌细胞凋亡[10]。体外研究也发现，竹节参总皂苷对H2O2所致心肌细胞损伤具有保护作用，可有效抑制心肌细胞凋亡[11]。但竹节参总皂苷改善衰老大鼠心肌细胞凋亡的确切机制目前尚不完全明确。本研究将利用自然衰老模型大鼠，从心肌细胞自噬方面探讨竹节参总皂苷对自然衰老大鼠心肌细胞凋亡的保护作用及其可能的机制，为临床应用提供实验依据和理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物及饲料

SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠40只购自三峡大学实验动物中心，许可证号：SCXK（鄂）2011-0012。动物饲养于温度为20～23 ℃，湿度为55%～65%，12 h明暗交替的饲养室。自由摄食和饮水，并定期更换消毒垫料。

1.1.2 药物及试剂

竹节参药材采购自恩施州椿木营，经三峡大学生药学专家何毓敏博士鉴定为正品竹节参。TSPJ由本研究团队提取分离，其提取率为23%。以竹节参Ⅳa标准品为对照品，香草醛-高氯酸显色后采用紫外分光光度法测得TSPJ的相对纯度为80.3%[12]。BCA蛋白浓度定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；Tunel-细胞凋亡原位检测试剂盒(10768100)，德国Roche公司；Bax（sc-7480）购自美国Santa Cruze公司；Bcl-2（#625509）购自美国R&D Systems公司；Caspase-3（ab44976）、Caspase-9（ab52298）、p62（ab56416）、Beclin1（ab207612）购自美国Abcam公司；LC3Ⅰ /Ⅱ( # 12741)购自美国cell signaling公司；GAPDH(#5174)购自美国Cell Signaling公司；辣根过氧化酶标记的兔抗山羊（111004）、山羊抗兔（125510）均购自武汉科瑞生物技术有限公司。BCA蛋白浓度定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；Bax（sc-7480）购自美国Santa Cruze公司；Bcl-2（#625509）购自美国R & D Systems公司；Caspase-3（ab44976）、Caspase-9（ab52298）、p62（ab56416）、Beclin1（ab207612）购自美国Abcam公司；LC3Ⅰ /Ⅱ(#12741)购自美国cell signaling公司；GAPDH(#5174)购自美国Cell Signaling公司。辣根过氧化酶标记的兔抗山羊（111004）、山羊抗兔（125510）均购自武汉科瑞生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器

IX53型光学倒置显微镜，日本 Olympus公司；LEICA EG 1150H型石蜡包埋机、LEICA TP 1020型自动脱水机、LEICA EG 1150C型超薄切片机，德国Leica公司；Power Pac TM Basic电泳仪，美国Bio-Rad公司；Bioshine Chemi Q 4800化学发光凝胶成像自动显影仪，上海欧翔科学仪器有限公司；JA2003电子分析天平，上海天平仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药

将30只18月龄SD雄性大鼠随机分为衰老模型组、TSPJ低剂量组、TSPJ高剂量组。衰老模型组给予等量正常饲料，TSPJ低、高剂量组分别投食给予TSPJ 10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，连续给药 6 个月至24月龄，每天1次。另取10只6月龄大鼠做青年对照组。动物处理前一晚禁食不禁水，第二天腹腔注射20%乌拉坦5 mL/kg待麻醉后，腹主动脉取血并快速取出心脏组织，用预冷的生理盐水洗净擦干后，存储于-80 ℃冰箱以备使用。

1.2.2 大鼠心脏组织HE染色

待大鼠麻醉后腹主动脉取血，快速取出心脏组织，经生理盐水冲洗后，沿垂直于纵轴中间靠心尖的位置将心脏切割成2～3 cm厚的组织块，多聚甲醛固定24 h后，再用75%乙醇再放置24 h。经脱水机梯度酒精脱水，二甲苯透明、石蜡包埋，切片。根据HE染色步骤先经二甲苯脱蜡，不同浓度酒精复水（由高到低），放入双蒸水中，苏木精染核和伊红染色后，再梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后将组织置于通风处待残留的甲苯挥发干净后，滴加中性树胶封片。待片子略干后，于倒置光学显微镜下仔细观察大鼠心脏组织形态变化，并在不同视野随机取图。

1.2.3 Tunel试剂盒检测大鼠心肌细胞凋亡

石蜡切片经常规脱蜡脱苯入水处理后，按照Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒的操作步骤染色，光镜观察，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈棕褐色。于200倍的光镜下每张切片随机选择2～3个视野，计算每个视野中凋亡细胞核数和总细胞核数，计算心肌细胞凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%。

1.2.4 Western blot检测大鼠心脏组织中相关蛋白的表达

-80 ℃取组织样本，称取心脏组织约40 mg，各组加入约500 μL裂解液，用匀浆机研磨，静置、离心后，吸取上清液。用BCA法蛋白定量。蛋白变性后，SDS-PAGE跑胶，先80 V恒压约30 min后，110 V恒压电泳直至 Marker条带完全跑开；切下所需目的条带，250 mA恒流转膜100 min。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜；洗涤一抗后，加入相应标记的二抗，再清洗二抗，室温孵育1 h，加入ECL显影液显色。

1.2.5 统计学处理

采用GraphPad Prism 5、Image J软件进行统计分析，实验数据采用均数±标准差（±sd）表示。采用单因素方差分析法比较各组间差异的显著性，p＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 竹节参总皂苷对衰老大鼠心脏组织形态学的影响

光镜可见青年对照组中大鼠心肌纤维排列整齐紧凑，结构清晰，心肌细胞形态形态、胞质及间质均正常；与青年对照组相比，自然衰老模型组中大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增大，心肌细胞变性增多，间质纤维增生，肌纤维断裂。与 24月龄相比，TSPJ低、高剂量组大鼠心肌纤维形态得到明显改善，纤维排列整齐，心肌细胞炎性浸润减轻，间质纤维增生减少。结果如图1所示。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态学改变(×200)Fig.1 Pathologic changes of myocardium tissues of rats in each group (×200)

2.2 TSPJ 对衰老大鼠心肌细胞凋亡的影响

图2 竹节参总皂苷对衰老大鼠心肌细胞凋亡的影响（×200）Fig.2 The cardiomyocyte apoptosis of each group (×200)

Tunel法的原理是细胞凋亡过程中基因组DNA发生断裂，脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)可催化标记这些DNA链断裂和缺口处的3'-OH末端，进行后续识别，将正常细胞核染成蓝色，凋亡阳性细胞核染成棕褐色。结果显示，与6月龄相比，24月龄大鼠细胞凋亡数显著增加；而 TSPJ干预后心肌细胞凋亡数量明显减少，见图2。统计结果表明，与6月龄大鼠相比较，24月龄大鼠的心肌凋亡指数上升3倍；与24月龄大鼠比较，TSPJ低、高剂量组大鼠的凋亡指数分别降低49%和55%，如图2所示。

2.3 TSPJ对衰老大鼠心脏组织 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的影响

图3 各组大鼠心脏组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的变化Fig.3 The protein expression of Caspase-3 and Caspase-9 in the cardiac tissues of each group

图4 各组大鼠心脏组织中Bcl-2、Bcl-2/Bax、Bax蛋白表达量的变化Fig.4 The protein expression of Bcl-2、Bcl-2/Bax and Bax in the cardiac tissues of each group

随着年龄增长，心脏的收缩舒张功能逐渐衰退、僵硬度增加、顺应性降低，并伴随着心肌细胞凋亡增加、氧化应激及自噬功能障碍等，最终导致心血管疾病的发生。由死亡受体和线粒体细胞色素C途径介导，经过一系列级联反应激活 Caspase家族（cysteiny laspartate specific proteinase）最终导致细胞凋亡。凋亡抑制基因Bcl-2可调节线粒体膜通透性，以阻止细胞色素C释放进入胞质，且对下游Caspase也有抑制作用，从而减少细胞凋亡。Bax与Bcl-2为同源分子，但其功能相反，是促细胞凋亡的代表[13,14]。Western Blot结果显示，与6月龄相比，24月龄组大鼠心脏中Bax、Caspase-3和 Caspase-9的蛋白表达量分别提高了9.5倍，1.8倍和4.1倍，Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值下降98%和99%，给予TSPJ干预后，与24月龄大鼠相比，TSPJ低剂量组中Bax蛋白水平下降87%，Bcl-2的表达以及 Bcl-2/Bax比值分别上升 6.5倍和19.75倍；竹节参高剂量组中Bax、Caspase-3、Caspase-9分别下调87%、65%、70%，Bcl-2的表达以及Bcl-2/Bax比值分别升高了12.75倍和138.5倍。Tunel和Western blot结果显示，TSPJ能有效干预自然衰老过程中心肌细胞凋亡指数以及促凋亡蛋白Bax和Caspase3等蛋白的表达，提高Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax比值。说明大鼠心脏组织在衰老过程中心肌细胞凋亡增多，而TSPJ能显著改善自然衰老大鼠的心肌细胞凋亡，且呈剂量依赖性。如图3、4所示。

2.4 TSPJ对衰老大鼠心脏组织 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Beclin1蛋白表达的影响

自噬诱导细胞发生凋亡抵抗，当细胞自噬受阻，凋亡进程明显加速[15]。而自噬功能障碍是心脏衰老的重要特征之一，心肌细胞终末分化的特性使得难以清除细胞内受损的大分子和细胞器，导致细胞稳态下降[16]。增强自噬活性有助于心肌细胞存活，并在对严重损伤（如心肌梗死、缺血和暴露于晚期糖基化终末产物）的反应时，可保护心脏免受病理性重塑和功能障碍[17]。有研究表明，自噬相关基因ATG5敲除小鼠在衰老过程中会发展为扩张型心肌病，并伴有严重的收缩功能障碍[18]；长期服用自噬激活剂雷帕霉素可以延长小鼠的寿命[19]。本实验结果也显示，与6月龄大鼠青年对照组比较，24月龄自然衰老组大鼠中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1蛋白表达水平分别下降了70%和48%，p62表达显著增加3.4倍，而TSPJ低剂量组衰老大鼠心脏组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表达分别升高了5.68倍和2.6倍，p62表达减少了57%；竹节参高剂量组衰老大鼠心脏组织中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表达分别升高了5.68倍和2.6倍，p62表达减少了65%。从Western Blot结果显示，TSPJ能有效提高自然衰老过程中心肌细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表达，减少p62表达。说明大鼠心脏组织在衰老过程中自噬能力下降，而 TSPJ能显著增强自噬从而保护衰老大鼠心脏组织，如图5所示。

图5 各组大鼠心脏组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1蛋白表达的变化Fig.5 The protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, p62, Beclin1 inthe cardiac tissues of each group

3 结论

3.1 HE和Tunel染色结果显示衰老大鼠心脏组织中心肌纤维排列疏松紊乱，心肌细胞变性，间质纤维增生，心肌细胞凋亡指数上调3倍。经TSPJ干预后，自然衰老大鼠心肌形态得到明显改善，纤维排列整齐，心肌细胞炎性浸润减轻，间质纤维增生减少，低、高剂量竹节参组心肌细胞凋亡指数分别下降 49%和55%。Western Blot结果也显示在衰老过程中，促凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表达水平分别增加9.5倍、1.8倍和4.1倍，p62表达显著增加3.4倍，抑凋亡蛋白Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比值分别下降98%和99%，且自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平分别下降了70%和48%；与24月龄衰老大鼠相比，TSPJ能激活自噬且抑制大鼠在自然衰老过程中凋亡相关蛋白表达水平。在TSPJ低剂量组中，促凋亡蛋白Bax和P62分别下降了87%和57%，抑凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-2/Bax比值及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1分别上调6.5倍、19.75倍、5.68倍、2.6倍；TSPJ高剂量组促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9和p62分别下调87%、65%、70%和65%，Bcl-2、Bcl-2 /Bax比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表达分别升高了12.75倍、138.5倍、5.68倍、2.6倍。

3.2 本研究的结果证实了在衰老大鼠模型中，心肌细胞自噬活性下降，凋亡指数增高，经竹节参总皂苷干预后，凋亡指数明显下降，上调 Bcl-2蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1表达量，下调凋亡相关蛋白Bax、Caspase3、Caspase9和p62表达量。因此我们得出结论：竹节参总皂苷对自然衰老大鼠心脏具有较好的保护作用，其机制可能是通过激活自噬过程，抑制心肌细胞凋亡，本研究为进一步阐明竹节参总皂苷延缓衰老作用提供实验室基础。