生物转化的人参皂苷F2分离及其结构鉴定

何丹

辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009

引言

人参皂苷是药材人参的最重要的活性成分之一，口服人参后，大多数多糖基的人参二醇类皂苷（PPD）不能被人体直接吸收，通常会在人体消化系统中的酶和肠道菌的作用下，水解掉苷元上连接的糖基生成活性更高的低糖基皂苷，例如F2和C-K等天然人参中含量极低的稀有皂苷[1]。如果在体外完成这种转化，会提高人体的利用率。因此，在体外制备人参皂苷F2对人参乃至医药行业具有重要意义。

生物转化法是一种极具潜力的方法，用此法制备低糖基的皂苷具有环境友好、副产物少、后处理简单等诸多优点。本实验室在此方面做了大量的研究，已经发现了能转化多糖基二醇类人参皂苷的微生物，还有人参皂苷酶I型、II、型、III型、IV型[2-5]，其中的Ⅰ型人参皂苷酶可以水解PPD生成人参皂苷F2。本文利用Ⅰ型人参皂苷酶转化PPD生成的人参皂苷F2进行分离纯化，并利用核磁共振法鉴定其结构。

本文对用槐花诱导的sp.848菌产的人参皂苷Ⅰ型酶转化人参二醇类皂苷PPD制备的粗品人参皂苷C-K进行了分离纯化，经高效液相色谱分析产品纯度，并用核磁共振法确定了产物的结构。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

人参皂苷标准品F2、C-K，PPD酶反应产物（主要含F2），本实验室提供；薄层层析板Silica gel 60-F254，德国Merck公司产品；AB-8树脂、D-296树脂，南开大学化工厂生产；柱层层析硅胶，青岛海洋化工厂分厂产品；高效液相色谱仪，美国Waters公司；

1.2 试验方法

1.2.1 人参皂苷F2的分离纯化

取50g脱糖脱色后的、来源于酶转化PPD的人参皂苷F2粗产品，与125倍体积的80-100目硅胶混合，制成样品胶，用900g的300-400目的硅胶作为分离胶进行分离。用V（氯仿）：V（甲醇）= 9∶1的洗脱液洗脱，将相同的组分收集合并，干燥、称重。取纯度最高的F2产品进行高效液相色谱及核磁共振检测。

1.2.2 薄层层析法

用薄层层析法对皂苷进行检测，展开剂为V(氯仿)：V(甲醇)：V(水)=7∶2.5∶0.5，显色剂为10%的硫酸溶液，加热显色。将样品点与标准品点对照以确定样品中所含皂苷成分[6]。

1.2.3 高效液相色谱检测产品纯度

经硅胶分离得到的产品采用高效液相色谱法分析，美国Waters 2695型高效液相色谱仪、Waters 2996二极管阵列检测器、Empower2色谱工作站；色谱柱为Knauer (5 μm,250 mm×3 mm）；流动相为乙腈（A）和水（B）；进样量，10 μL；柱温，35℃；流速，0.6 mL/min；检测波长，203 nm。流动相比例见表1：

表1 流动相比例表Table 1 Rate of mobile phase

1.2.4 核磁共振法分析产品结构

采用核磁共振法检测人参皂苷F2的结构，测试仪器为瑞士Bruke AVANCE 600 超导核磁共振波谱仪，检测条件为探头5 mm BBO，溶剂为Pyridine-D5 (氘代吡啶)。

2.结果与讨论

2.1 硅胶柱层析法分离人参皂苷F2

本实验室前期已经利用豆粕诱导的sp.848菌产的人参皂苷Ⅰ型酶转化人参二醇类皂苷PPD制备了粗品人参皂苷F2。取经过脱糖脱色处理后的F2粗品50g，进行硅胶柱层析分离，得到高纯度的F2 共4.19g，得率8.38%。TLC检测结果如图1所示：

图1 硅胶分离的F2的TLC检测图Figure 1 TLC of ginsenoside F2 after separation by silica gel

从图1可以看看出，样品与F2标准品的迁移率相同，说明为同一种物质。然后采用HPLC检测样品，结果如图2所示。

图2 硅胶分离的F2的HPLC图谱Figure 2 HPLC of ginsenoside F2 after separation by silica gel

由图可知，分离得到的F2产品的纯度约为96.7%。

2.2 人参皂苷F2的结构分析

采用核磁共振法对经硅胶柱分离得到的纯品进行结构鉴定。其一维13C核磁共振谱（13C NMR）如图3所示：

图3 样品F2的一维13C NNE核磁共振谱全图Fig. 3 13C NNE NMR full Score of F2

根据一维13C核磁共振谱图分析：从一维13C NMR定量谱中可以观察到42条谱线，谱线无重叠。积分面积为原子个数相对比，故由相对积分面积可知，该样品中含有42个碳原子。烯碳区（δ 120～130 ppm）的两条谱线是由2个烯碳所贡献的，说明化合物中含有－CH＝C＜独立双键结构。氧碳区（δ 60～110 ppm）共有15条谱线，是由人参皂苷中与氧相连的碳所贡献的，此区应该有1个季碳，2个－CH2－质子碳和12个＞CH－质子碳。其中，最低场的δ 107.10 ppm位移峰应归属于3-O-Glc上的第1’号碳，δ 98.42 ppm位移峰归应属于20-O-Glc上的第1’号碳，这两个位移峰由于受到糖苷键的影响而落到此处。位于氧碳区最高场的δ 63.04 ppm、δ 63.24 ppm位移峰应分别归属于20-O-Glc上的第6’号碳和3-O-Glc上的第6’号碳所贡献。氧碳区最低场的δ 107.10 ppm、δ 98.42 ppm位移峰应分别归属于3-O-Glc上的第1’号碳和20-O-Glc上的第1’号碳所贡献。人参皂苷元为饱和四环式结构，化学位移值相差很小，甲基位移十分相近。通过对比13C NMR谱该区域（δ 0～110 ppm）各位移峰的化学位移和文献[7]中的数据，确定了样品F2结构中1～30号碳的化学位移。如表3所示。从表3中可以看出，第22号碳化学位移落在δ 36.31 ppm、第21号碳化学位移落在δ 25.95 ppm，说明该化合物为20(S)构型。

图3 样品F2的一维13C NNE核磁共振谱全图Fig. 3 13C NNE NMR full Score of F2

综上所述，样品为人参皂苷C-K（3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇），结构式如图4所示，分子式为C42H72O13，分子量为785.01。

图4 人参皂苷F2结构Figure 4 Structure of ginsenoside F2

3 . 结论

本文采用硅胶柱层析法，对前期采用生物酶转化法制备、并经脱糖脱色处理过的粗品人参皂苷F2进行了分离纯化，并采用核磁共振法测定了其结构。50g的F2粗品经硅胶层析分离后，得到纯度为96.7%的F2共4.19g，得率为8.38%。采用核磁共振（NMR）法对分离后的产品进行分析鉴定，最终确定了其结构，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇，分子式为C42H72O13，分子量为785.01。