TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

陈桂华 李翔辉 郁川

【摘   要】 为得到TAT-Apoptin融合蛋白，以pMD-19T-Apoptin为模板PCR扩增出TAT-Apoptin基因，构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin，并对TAT-Apoptin蛋白进行表达。PCR和测序表明，成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin，进一步对其进行蛋白表达，发现该蛋白能与Apoptin多抗发生特异性结合。以上结果证明，TAT-Apoptin基因原核表达载体构建成功，并能在Rosetta中进行分泌性表达。

【关键词】 TAT-Apoptin融合蛋白;重组载体pET-32a-TAT-Apoptin;分泌性表达

[Abstract]  In order to obtain TAT-Apoptin fusion protein， TAT-Apoptin gene was amplified by PCR with pMD-19T-Apoptin as template， the recombinant vector pET-32a-TAT-Apoptin， was constructed and the TAT-Apoptin protein was expressed. PCR and sequencing showed that the recombinant vector pET-32a-TAT-Apoptin， was successfully constructed to further express the protein， and it was found that the protein could specifically bind to Apoptin polyantibodies. The above results show that TAT- apoptin base The prokaryotic expression vector was successfully constructed and secreted in Rosetta.

[Keywords]  TAT-Apoptin fusion protein; secretory expression of recombinant vector pET-32a-TAT-Apoptin

凋亡素（Apoptin）是雞贫血病毒（chicken anemia virus， CAV）基因编码的一种小分子功能蛋白，导入哺乳动物细胞后可表达凋亡素并诱导肿瘤细胞凋亡，对正常二倍体细胞则无影响[1，2]。但天然状态下的Apoptin无法穿透细胞膜，人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV1）的反式激活蛋白（trans-activator transcription， TAT）可以在不损害细胞的情况下跨膜转运与之融合表达的蛋白[3]。我们利用TAT这一特性，将TAT的编码基因与外源蛋白基因Apoptin连接，表达TAT-Apoptin融合蛋白，该融合蛋白既有穿透性，又不影响外源蛋白的活性。鉴于此，我们构建了原核表达载体pET-32a-TAT-Apoptin，并对TAT-Apoptin蛋白进行表达，从而为TAT-Apoptin的抗肿瘤作用研究奠定了一定的基础。

1  材料和方法

1.1  细菌菌株和载体

pMD-19T-Apoptin质粒由河南科技大学动物疫病与公共安全实验室构建保存;E.coli-JM109、原核表达载体pET-32a、宿主表达菌菌株Rosetta均由本实验室保存。

1.2  试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、T4 DNA Ligase、限制性内切酶EcoR I和Sal I、蛋白Marker均购自Takara（大连）有限公司;质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司;LB培养基购自英国OXOID公司;兔抗Apoptin多抗购自武汉华美生物工程有限公司;硝酸纤维素膜、碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔二抗、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司;IPTG诱导剂购自Sigma公司;氨苄青霉素购自生工生物（上海）股份有限公司。

1.3  方法

1.3.1 引物设计与合成  根据GenBank中的CAV基因组序列（GenBank： AF199501）及相关文献中[4]报道的TAT序列，运用Primer Primer 5.0引物设计软件设计并合成如下特异性引物：TAT-Apoptin引物：

1.3.2 TAT-Apoptin基因的克隆与鉴定  以构建好的pMD-19T-Apoptin为模板，利用1.3.1设计合成的引物扩增出TAT-Apoptin融合基因，并于pET-32a进行连接，转化大肠杆菌Rosetta中，挑取单菌落分别进行PCR鉴定和酶切鉴定，阳性重组质粒送上海生工测序。

1.3.3 TAT-Apoptin融合蛋白的表达鉴定  挑取含有重组质粒的Rosetta单菌落，接种到4ml（LB+A）液体培养基中，于37℃、200rpm振摇过夜培养。取50ul过夜培养物转接到5ml（2×YT+A）培养基中，于37℃、200rpm振摇培养4h左右加入1mmol浓度的IPTG，28℃、180rpm诱导表达7h后离心菌体，PBS洗两遍，再用PBS重悬菌体，超声破碎后再次离心，用200ul的PBS重悬沉淀，并分别于上清和沉淀中加入适量5×蛋白上样液，100℃煮沸10min点样进行SDS-PAGE蛋白电泳，而后进行Western-blot鉴定。

2   结果

2.1  TAT-Apoptin基因的擴增

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳显示大小为411bp，与预期大小一致（见图1）。

2.2   pET-32a-TAT-Apoptin鉴定

对pET-32a-TAT-Apoptin进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出411bp的目的条带（见图2）;经EcoR I和Sal I双酶切后出现大小分别为5900bp和411bp的两条带（见图3）。结果表明，目的片段以正确方向插入原核表达载体pET-32a中。对克隆片段进行序列测定及分析后，结果显示重组载体pET-32a-TAT-Apoptin中包含完整的Apoptin基因及TAT序列，其中Apoptin基因序列与GenBank（AF199501）中发表的鸡贫血病毒CAV基因序列相比同源性为99.7 %。但氨基酸序列同源性为100 %，说明克隆片段为TAT-Apoptin基因序列。

2.3  TAT-Apoptin蛋白的表达鉴定

含有重组质粒的Rosetta经IPTG诱导后，Western-blot显示在约34 kDa处有TAT-Apoptin蛋白条带，并且存在于过滤的上清中，表明TAT-Apoptin可在Rosetta中获得分泌表达（见图4）。

3   讨论

肿瘤细胞的不受控增殖性是肿瘤难以治疗的重要原因之一，如何促使肿瘤细胞凋亡成为各国学者探究的热点[5]。研究发现，Apoptin可以选择性促使肿瘤细胞凋亡，但是，处于天然状态下的Apoptin透过细胞膜促使肿瘤细胞凋亡相当困难。因此，如何使Apoptin在肿瘤组织聚集并顺利进入体内肿瘤细胞，发挥其肿瘤特异性杀手的效用，是当前亟待解决的问题。研究证实，HIV-1的反式激活因子TAT可携带小分子蛋白跨膜进入细胞[3]，具有广谱蛋白转导作用。因此，本实验将二者结合探究其在原核表达载体中的表达情况，为后续纯化TAT-Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡奠定了基础。

本实验构建的TAT-Apoptin在Rosetta中具有很高的表达量，且目的蛋白大量出现在裂解上清中，说明其主要以分泌形式进行了表达，这可能与Rosetta中含有的稀有密码子有关，这些稀有密码子为Rosetta菌提供了“万能”翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。

综上所述，本研究成功构建了能高效表达TAT-Apoptin蛋白的原核表达载体pET-32a-TAT-Apoptin，为进一步探索Apoptin的抗肿瘤作用研究提供了一定材料。

参考文献：

[1]  Yuasa N， Taniguchi T， Yoshida I. Isolation and some properties of an agent iducing anemia in chicks[J]. Avian Dis， 1979，23（2）： 366-385.

[2]  Noteborn MH， Todd D， Verschueren CA， et al. A singlechicken anemia virus protein induces apoptosis [J]. J Virol，1994， 68（1）： 346-351.

[3] S Debaisieux， F Rayne， H Yezid， et al. The ins and outs ofHIV-1 Tat[J]. Traffic， 2012， 13（3）： 355-363.

[4]  L Guelen， H Paterson， J Gaken， et al. TAT-apoptin is effi ciently delivered and induces apoptosis in cancer cells[J].             Oncogene， 2004， 23（5）： 1153-1165.

[5]  LT Jia， SY Chen， AG Yang. Cancer gene therapy targeting cellular apoptosis machinery[J]. Cancer Treat Rev， 2012， 38  （7）： 868-876