mRNA的N6-甲基腺嘌呤研究进展

，， ，林嵩，

(河南师范大学 生命科学学院,河南 新乡 453007)

真核生物RNA中已发现的化学修饰约150种，主要发生在tRNA、rRNA及其他非编码RNA上，这些修饰能够参与真核生物基因表达的调控。真核生物mRNA中也存在多种化学修饰，如5′端帽子N7-甲基鸟嘌呤(N7-methylguanosine，N7-G)、N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)、N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine，m1A)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)、假尿嘧啶核苷(ψ)和2′-O-甲基化修饰(2′-O-methylation)等，其中m6A是mRNA中最常见的一种修饰[1]。m6A修饰广泛存在于哺乳动物和植物的mRNA中[2]，但由于缺乏m6A特异碱基的检测技术，其研究较为缓慢，m6A修饰在生物体内的具体功能也不清楚。随着m6A免疫共沉淀高通量测序(MeRIP-seq)技术的应用，m6A的全转录组水平已在多种生物体内被检测，引起了诸多学者对m6A分布特征、甲基化和去甲基化动态调控以及m6A识别的关注，并开展了大量的研究工作，m6A的重要生物学功能也逐渐被人们所认识。基于此，综述了近年来动物和植物中关于m6A的研究进展，包括m6A的分布特征、动态调控、m6A的识别和对mRNA的调控等，以期全面理解m6A修饰在真核基因表达调控和生物体生长发育中的重要作用。

1 m6A修饰的分布特征

目前，采用MeRIP-seq技术已获得了酵母、人、鼠、拟南芥和水稻的m6A修饰图谱，结果显示，m6A在真核生物mRNA中的分布具有一定的保守性，主要集中在mRNA的终止密码子附近和3′非编码区(UTR)，并且存在一致的(G/A)(G/A)AC(A/C/U)甲基化靶序列[3-8]。除3′UTR，m6A在mRNA内含子中也存在，表明转录和甲基化修饰可能同时进行[9]。植物和动物中m6A在mRNA上的分布存在一定的差异，如拟南芥和水稻中m6A修饰除在3′端富集外，也在mRNA5′端翻译起始位点附近富集[3,5]；哺乳动物mRNA中m6A修饰常存在于长外显子内，而拟南芥和水稻不具有这一特性[3,7]。哺乳动物大约1/3的转录本中可以检测到m6A修饰，每个转录本中m6A修饰位点数目也不尽相同，大多数转录本仅存在1～2个m6A修饰位点，而少数基因则有多个修饰位点[7-8]。植物转录组中m6A修饰高达50%，甚至76%[3-5]。

m6A修饰在生物体内的分布具有一定的组织特异性，如，哺乳动物中m6A在肝脏、肾脏及大脑中的含量明显高于其他组织[9]；拟南芥的花苞中经m6A修饰的转录本比例明显高于根和叶片[4]；水稻的愈伤组织和叶片中m6A修饰图谱也存在明显差异[5]。这一组织特异性表明，m6A修饰在生物体组织器官的发育和分化中发挥一定的功能。

2 m6A甲基化的动态调控

已知DNA和组蛋白存在甲基化/去甲基化动态可逆修饰过程，从而影响基因表达和蛋白质功能等重要生命过程，现已证明m6A甲基化修饰也是一个动态可逆的过程，由甲基转移酶和去甲基化酶共同调控这一过程[10-11]。人们形象地将m6A的甲基转移酶称为编码器(Writer)，将去甲基化酶称为消码器(Eraser)[1]。

2.1 m6A的编码器

RNA中m6A甲基化由复杂的蛋白质复合体介导完成。METTL3(又称MTA-70)是第1个被鉴定的m6A甲基转移酶复合体成员，首先在HeLa细胞中被发现[10]，随后其同源基因在酿酒酵母、果蝇和拟南芥中被报道[12]。METTL14是m6A甲基化转移酶复合体中的另一个核心成员，与METTL3高度同源，可与METTL3发生互作[12]。在体外METTL3和METTL14形成的异源二聚体比其单个具有更高的甲基转移酶活性，表明两者可能协同发挥甲基化作用[13-14]。研究表明，METTL3具有S-腺苷甲硫氨酸依赖的RNA甲基转移酶活性，而METTL14主要负责结合RNA底物[15]。m6A甲基转移酶复合体中的第3个关键组分是WTAP，在体外它并不影响METTL3/METTL14的甲基转移酶活性，但是WTAP缺失可明显降低细胞内m6A水平[16-17]。WTAP被认为是m6A甲基转移酶复合体的调节亚基，负责招募m6A甲基转移酶复合体其他成分结合到目标RNA上[17]。KIAA1429和RBM15(或RBM15B)是新发现的m6A甲基转移酶复合体的成分。KIAA1429是哺乳动物m6A甲基化所必需的，主要参与mRNA的3′UTR和终止密码子的甲基化，KIAA1429沉默可降低m6A水平[18]。在人的胚胎肾细胞中，敲低RBM15和RBM15B可降低m6A水平，破坏XIST介导的基因沉默[19]。免疫共沉淀分析显示，在哺乳动物细胞内RBM15和RBM15B可与METTL3互作，并且这一互作依赖WTAP蛋白[20]。最近，另一种m6A甲基转移酶METTL16在人体细胞中被发现，主要负责U6 snRNA和MAT2A mRNA的甲基化[15]。

近年来，模式植物拟南芥中m6A甲基转移酶复合体的几个亚基也已被鉴定。其中，与人的METTL3同源的蛋白质为MTA(At4g10760)，其等位基因无效突变可引起拟南芥植株胚胎致死[4]。在胚胎特异表达基因ABI3启动子作用下表达MTA可回补mta突变体的致死效应，植物可开花结实[21]。拟南芥mta突变体中m6A水平仅为野生型的5%～15%，表明该酶是mRNA m6A甲基化所必需的[21]。拟南芥中与人的METTL14同源蛋白质为MTB，mtb突变体的表型与mta类似，如生长延缓、顶端分生组织异常、根生长抑制和向地性异常，这些表型均与m6A水平的降低有关[22]。拟南芥中FIP37蛋白与人的WTAP同源，可与MTA发生互作，FIP37突变可引起胚致死和发育受阻，过表达FIP37可增加植物毛状体的分枝[21,23]。MTA和FIP37主要定位于细胞核，表明m6A修饰主要发生在细胞核内[4,23]。

2.2 m6A的消码器

m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的发现揭示了mRNA中m6A甲基化是一个动态可逆的过程。FTO和ALKBH5均属于AlkB家族，是一类双加氧酶，尽管两者均可结合单链RNA使m6A去甲基化，但它们的反应途径并不相同，主要的组织定位也不相同。ALKBH5可直接将m6A转变为A，FTO则需要催化生成2个中间物hm6A和fm6A之后才使m6A去甲基化[11]。ALKBH5主要在哺乳动物的睾丸中表达，参与精子的形成；FTO主要在脑组织中表达，尤其是神经组织中[24]。最近研究发现，FTO主要使mRNA的1号和2号帽子上的m6A脱去甲基[25]。过表达FTO或ALKBH5的细胞中m6A水平下降，但是敲低FTO和ALKBH5或敲除两者之一时，m6A的水平仅略微增加，表明尚有未知的其他去甲基化酶存在，它们可能与FTO和ALKBH5协同作用[26]。

拟南芥基因组可编码13个AlkB家族蛋白质，其中ALKBH9B和ALKBH10B与人的ALKBH5同源，均有m6A去甲基化酶活性[27-28]。敲低ALKBH9B可降低病毒对植物的入侵，但m6A修饰在宿主和病原体互作中的作用机制目前还不清楚[27]。拟南芥alkbh10b缺失突变体表现为开花延迟和生长受到抑制，反之，过表达ALKBH10B的拟南芥植株出现早花的表型[28]，表明m6A可逆甲基化修饰参与植物的花期控制。

3 m6A的读码器

与DNA和组蛋白的甲基化相似，m6A修饰的RNA可被特异蛋白质或读码器(Reader)识别，从而将信息传递给下游的应答因子。以甲基化的RNA作为探针诱饵，在哺乳动物中发现了几个m6A结合蛋白，如YTHDF2和YTHDF3[8]。随后其他YTH家族蛋白质包括YTHDF1、YTHDC1和YTHDC2也被鉴定[29-30]。生化结构分析表明，YTH家族蛋白质在C端具有保守的RNA结合结构域，该结构域内由几个色氨酸和酪氨酸残基构成的芳香环可识别m6A[30-31]。通常，YTHDF1/2被认为是细胞质内m6A读码器，YTHDC1为细胞核内m6A读码器。最近，研究发现了一种不含YTH结构域的m6A读码器IGF2BP1/2/3，可以提高mRNA的稳定性和翻译效率[32]。

拟南芥有13个含YTH结构域的蛋白质，包括ECT1—12和CPSF30。SCUTENAIRE等[22]对植物中含YTH结构域的蛋白质进行进化分析，发现YTH结构域均有1个典型的芳香环，因而有一个疏水空穴可以容纳并识别m6A。与动物不同的是，植物中YTH结构域的蛋白质并非完全功能冗余，它们与m6A有不同的亲和能力[21]。ECT2是新被鉴定的拟南芥中m6A读码器，属于YTH家族蛋白质，主要在细胞核和细胞质中表达，负责识别3′非编码区的m6A，具有植物特有的m6A识别靶序列UGUA[33]。与野生型拟南芥相比，ect2突变体的毛状体分枝明显增加[21,33]。与动物中YTHDF2蛋白促进mRNA降解不同，ECT2提高细胞质中mRNA的稳定性[33]。随后发现，ECT3在拟南芥中也有较高的表达量，并与ECT2共同参与了植物毛状体的早期发育过程，ect2ect3双突变体出现新的表型，延迟第一片真叶的出现[33]。ECT2的同源基因ECT4缺失的突变体第一真叶延迟出现的表型更加明显，表明ECT2、ECT3和ECT4对维持植物正常的叶片形态较为重要[33]。

4 m6A修饰对mRNA的调控

2012—2016年，随着全转录组水平m6A检测技术的发展，m6A修饰在许多细胞活动中的功能研究取得突破。早期的研究预测到m6A修饰在转录后的调控作用，可能参与mRNA的剪切加工、转运及储存，甚至影响从mRNA到蛋白质的翻译过程。

4.1 m6A修饰对mRNA稳定性的调控

多个研究证实，m6A修饰可以降低mRNA稳定性[7,12,34]。敲低小鼠胚胎干细胞中的m6A甲基转移酶基因METTL3或METTL14，m6A水平降低，同时靶向mRNA稳定性增加[15,34]。但是DOMINISSINI等[7]比较了非靶向siRNA对照和敲低METTL3的细胞中m6A修饰的mRNA的表达水平，发现m6A可增强mRNA稳定性，可能由于m6A是mRNA正确拼接需要的。另一个研究表明，读码器YTHDF2可结合m6A，并将结合的mRNA由翻译装置运至细胞质处理小体(P-bodies)，促进mRNA的降解[35]。ZHANG等[36]研究发现，m6A通过YTHDF2介导Notch1ɑmRNA的稳定性，以维持内皮-造血转化(EHT)过程中内皮细胞和造血细胞基因表达的平衡，进而调控造血干细胞的命运决定。体外研究表明，m6A可能通过阻止mRNA稳定因子HuR(Human anigen R)与mRNA的结合，降低mRNA的稳定性[12]。

m6A修饰对植物mRNA稳定性的影响尚无定论。LUO等[3]发现，m6A修饰水平与mRNA的丰度存在正相关；而WAN等[4]发现，拟南芥不同组织中m6A修饰水平与mRNA的丰度存在负相关，间接说明了m6A修饰可降低mRNA稳定性。最近的研究表明，拟南芥中m6A的读码器ECT2可提高细胞质中mRNA的稳定性，推测ECT2可能参与m6A介导的3′非编码区的可变多聚腺苷酸化[33]。

4.2 m6A修饰对mRNA拼接的调控

早期的研究发现，mRNA前体平均含4个m6A位点，而成熟的mRNA平均只有2个位点，表明m6A修饰可能主要发生在细胞核内，内含子的剪切导致成熟mRNA中m6A修饰的减少[37]；应用PAR-CLIP技术研究发现，METTL3的结合位点主要是在内含子内[17]；在能产生多个转录本的基因中，METTL3的结合位点和m6A修饰位点明显高于只有1个转录本的基因，表明m6A修饰与mRNA拼接及可变剪切关系密切[17]。m6A甲基转移酶复合体METTL3/METTL14/WTAP、去甲基化酶FTO和ALKBH5及m6A读码器YTHDF2和YTHDC1主要定位或部分定位于mRNA前体拼接的主要亚核结构——核斑点(Nuclear speckles)[38]，表明m6A在mRNA拼接中可能发挥调控作用。敲低METTL3或WTAP会产生不同的mRNA转录本，且现已知WTAP是一种拼接因子[16,39]。动物中，ALKBH5可影响拼接效率[24]。RNA结合蛋白HNRNPC负责mRNA前体加工和可变剪切，最近研究表明，m6A介导的mRNA结构重排可影响HNRNPC与mRNA的结合[39]，且mRNA的这种结构重排常常在外显子附近调控拼接。在敲除FTO的3T3-L1前脂肪细胞中，伴随5′和3′侧翼区m6A水平的增加，RNA结合拼接因子SRSF2的能力增加，其靶向外显子的概率增加[40]。体外试验表明，mRNA前体的拼接因子SRSF3和SRSF10可竞争性地与核读码器YTHDC1结合，而在体内YTHDC1可通过促进SRSF3、抑制SRSF10在核斑点的定位及与pre-RNA的结合参与调控mRNA的拼接[30]。

4.3 m6A修饰对mRNA翻译的调控

mRNA是蛋白质合成的直接模板，m6A在起始密码子、外显子和终止密码子附近的富集表明，其可能参与蛋白质翻译的调控。最近研究表明，m6A读码器YTHDF1可与蛋白质合成起始因子eIF3互作，提高经m6A修饰的mRNA的翻译效率[33]。随后研究显示，细胞受到胁迫如热休克时mRNA 5′UTR的m6A修饰增多并伴随着翻译效率的提高[41]。另一研究表明，METTL3可通过直接与翻译起始因子eIF3互作促进mRNA的翻译，而不依赖METTL3甲基转移酶活性或与YTHDF1或YTHDF2的结合[42]。但是最近一些体外翻译和报告基因转染细胞的研究表明，腺苷甲基化会导致翻译效率降低[43]。尽管m6A修饰不影响碱基配对，CHOI等[44]利用大肠杆菌核糖体系统并结合生化、结构和单分子的方法研究m6A修饰在mRNA/tRNA互作时发现，m6A修饰可干扰tRNA的选择和翻译的延伸，且这种干扰依赖密码子内m6A修饰所在的位置及密码子的序列，进而影响蛋白质的翻译。因此，m6A对不同mRNA翻译的影响可能有所不同。

5 展望

目前，多个物种的m6A全转录组图谱已被揭示，但要进行精确定位和定量分析仍需位点特异转录图谱，而测序技术仍需不断探索改进。近年来，动物中参与m6A修饰的甲基转移酶复合体的组分陆续被鉴定，但m6A编辑复合体的确切组成、调控和保守性尚未完全研究清楚。此外，研究表明，并非所有的mRNA均发生甲基化，且并非所有潜在的共有靶序列均发生甲基化，m6A选择性的机制及调控基础目前还不清楚。动物中已发现的m6A去甲基化酶主要有FTO和ALKBH5，但研究表明可能还有其他去甲基化酶的存在，有待进一步鉴定。m6A的读码器主要是一类含YTH结构域的蛋白质，该类蛋白质在哺乳动物中已被发现5个，此外新发现的不含YTH结构域的蛋白质IGF2BP1/2/3也可结合m6A，因此可能还有其他的含有YTH结构域的蛋白质或不含YTH结构域的蛋白质能够结合识别m6A，这有待证实。与动物相比，植物mRNA中m6A修饰研究还仅仅处于一个起始阶段，m6A修饰仅在拟南芥和水稻中被报道，植物mRNA中m6A修饰的分布特点、甲基转移酶的组分、去甲基化酶及识别蛋白均需进行大量研究。

已知m6A修饰是一个动态可逆的过程，什么情况下m6A修饰受动态调控;在生物体的不同发育阶段或者病理、逆境胁迫下，基因表达的调控是否依赖于甲基化的转录本;从整个表观遗传学角度看，RNA修饰如何与DNA甲基化、组蛋白修饰协同作用调控基因的表达，都有待于进一步探讨。