CAR-T细胞治疗实体瘤的归巢障碍及解决方法*

杨松林 李琳 段德仁 侯宗柳 综述 谭晶 审校

嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）细胞，经历近30年发展已经取得突破性进展。由于其在治疗血液系统肿瘤方面具有较好的疗效，因此，CAR-T 细胞治疗实体瘤已成为研究的热点。近年来，虽然有多项针对实体瘤的CAR-T 细胞治疗已进入临床试验阶段，但少有实质性进展，原因为实体瘤组织的异质性和复杂的肿瘤微环境以及CAR-T细胞难以归巢到肿瘤组织等因素限制了其在实体瘤中的应用［1］。本文结合CAR-T 细胞治疗实体瘤中所面临的归巢问题及解决方法进行综述。

1 淋巴细胞归巢在治疗实体瘤中的意义

肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lympho⁃cyte，TIL）在实体瘤的临床分期以及治疗中发挥重要的作用。TIL 最早由Rosenberg 等［2］于1986年从荷瘤小鼠肿瘤组织中发现并分离，被定义为已离开血液且与肿瘤细胞直接接触的淋巴细胞。近年来，TIL已被用于描述各种肿瘤内的细胞，如调节性T细胞（reg⁃ulatory cells，Tregs）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）［3］。有研究表明，与常规的恶性肿瘤淋巴结转移分期方法相比，将肿瘤组织中CD8+T、Tregs和CD4+T细胞的数量及比值作为分期标准能够更加准确地评估恶性肿瘤患者预后情况［4-5］，肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞含量较多且Tregs细胞含量较少的实体瘤患者通常预后更佳。

在CAR-T 细胞治疗实体瘤的过程中，其迁移到肿瘤部位为发挥杀伤作用的基本前提［6］，仅从外周血迁移至肿瘤部位的CAR-T细胞才有机会杀伤肿瘤细胞［7］，尤其是迁移到原发肿瘤组织和其他各处转移病灶的内部［8］。因此，具有免疫效应的CAR-T 细胞有效归巢为CAR-T细胞治疗实体瘤的重要环节。

2 淋巴细胞归巢到实体瘤的经典多步骤级联反应

淋巴细胞迁移到肿瘤组织中需经过包含多个步骤的级联反应，在该过程中淋巴细胞首先要通过外周血液循环到达肿瘤组织的血管中，然后穿透肿瘤血管到达肿瘤组织。实体瘤内的血管由内皮细胞层、内皮基底层以及周皮细胞组成。内皮基底层由层黏蛋白和Ⅳ型胶原蛋白组成，是淋巴细胞迁移过程中黏附分子的主要配体［9-10］；周皮细胞位于微血管的外缘，并参与控制毛细血管的通透性［11］。当发生肿瘤时，机体通过协调及控制淋巴细胞（尤其是T 淋巴细胞）与血管内皮层细胞间的旋转、爬行、黏连等多步骤的级联反应［12］，使淋巴细胞能够克服血液动力学的影响从而渗出血管并渗入病变组织中。

级联反应主要包括：1）淋巴细胞附着于血管内皮表面的细胞，以抵抗血液流动对T细胞产生力的作用；2）整合环境中趋化因子介导的信号分子，激活整联蛋白（通过在循环细胞上表达趋化因子受体）；3）整联蛋白介导的细胞牢固地黏附在内皮细胞表面上；4）内皮细胞移位［8］。级联反应的启动以及淋巴细胞归巢到肿瘤部位的关键为获得高度特异性的淋巴细胞归巢受体。当淋巴细胞获得归巢受体后，可靶向到达发病部位。

淋巴细胞利用相同或相似的趋化因子及配体逐步进入不同的正常组织或肿瘤内，并且不同组织之间所需的趋化因子和配体有部分为完全相同或架构相似，如VLA-4、LFA-1 和趋化因子受体家族CCR等［8］，尤其是G蛋白偶联受体CXCR3和CCR5常在黑色素瘤、乳腺癌和结直肠癌活跃的TILs 中表达［13］。因此，充分了解淋巴细胞归巢的过程以及迁移机制，有利于改善CAR-T细胞治疗实体瘤的应用策略以及增强CAR-T细胞治疗实体瘤的效果。

3 CAR-T在治疗实体瘤中的障碍

在治疗实体瘤方面，CAR-T 细胞具有丰富的特异性靶点可供选择。有研究提示，CAR-T 治疗实体瘤效果的Meta 分析表明，CAR-T 细胞在治疗实体瘤方面整体有效率约为9%，其中肝胆胰肿瘤的总有效率为11%、神经肿瘤为12%、其他肿瘤为12%［14］。Neelapu 等［15］开展111 例B 细胞淋巴瘤患者Ⅱ期临床试验，其客观有效率为82%，完全有效率为54%。CAR-T细胞在治疗白血病和淋巴瘤缓解率为70%～94%，此效果远远优于其在实体瘤治疗中的效果［16］。导致这种显著性差异的主要原因：1）CAR-T 细胞对肿瘤特异性抗原识别不佳：肿瘤细胞会产生选择性逃逸造成复发［17］；部分正常组织也会表达相同或相似肿瘤表面特异性抗原［18］，受到CAR-T 细胞攻击。2）肿瘤微环境抑制CAR-T 细胞：实体瘤周围环境中的氧含量、营养成分不足，以及高浓度的代谢酸导致T细胞无法增殖并产生细胞因子［19］。此外，实体瘤中富含Tregs、MDSCs 等，能抑制CAR-T 细胞的免疫活性及机体自身的免疫能力，使肿瘤细胞对免疫治疗产生耐药性［20］。3）CAR-T 细胞归巢障碍：CAR-T 归巢障碍为影响CAR-T 细胞疗效的最主要限制条件，主要与肿瘤组织的血管屏障作用以及实体瘤组织中基质的屏障作用有关。实体瘤组织中血管结构的紊乱和血管表面趋化因子的下调使实体瘤组织将CAR-T细胞予以拒之。即使有少部分的CAR-T细胞能够突破实体瘤的血管屏障，实体瘤基质的屏障作用也会阻挡这部分CAR-T细胞与肿瘤细胞的直接接触，并使CAR-T细胞深陷于肿瘤基质中无法移动，从根本上影响CAR-T细胞的实际杀瘤效果。

4 CAR-T细胞归巢到实体瘤并发挥效应的障碍

4.1 肿瘤组织的血管屏障

肿瘤组织血管的基本结构与正常组织血管的结构相比有较大差异，呈现3个分支及多分支结构。再加上受到体积不断增大的肿瘤细胞及基质的压迫影响，会造成肿瘤内血管正常功能的丧失、局部血流停滞或紊乱、时间和空间上呈不均一性以及无效循环增加［21］。肿瘤组织血管的这种改变，使注射入静脉的CAR-T细胞很难有效地随血液循环流至肿瘤组织周围的血管及微循环中，并使能黏附于肿瘤组织血管内皮表面的CAR-T 细胞数量降低。因此，能够浸润到肿瘤实质的CAR-T 细胞仅为注射细胞总数的2%，远远低于T 细胞能够发挥免疫毒性的有效细胞数量［22］。实体瘤内的血管内皮生长因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）与内皮细胞中表达的血管内皮生长因子受体-2（vascular endotheli⁃al growth factor receptor-2，VEGFR-2）相结合，促进实体瘤内血管的生成并造成低氧和酸性环境。实体瘤内新形成的血管具有异常血管床和基质，使CAR-T更加难以进入肿瘤内部。

实体瘤组织的血管屏障除上述的屏障作用外，还有基于受体和配体作用的屏障作用。肿瘤内皮细胞通过改变受体和配体的表达构成T 细胞浸润的屏障［19］，如在肿瘤新生血管内皮上会高表达血管内皮素B 受体（endothelin B receptors，ETBRs），并下调血管内皮细胞黏附分子-1（intercellular adhesion mole⁃cule-1，ICAM-1）的表达，干扰实体瘤周围CAR-T 细胞及TILs的浸润，从而发生免疫逃避［23］。

4.2 实体瘤组织的基质屏障

实体瘤与血液系统肿瘤不同，其基质具有强大的屏障作用使CAR-T细胞即使突破了血管屏障后也无法浸润到肿瘤组织的深部。正常的基质组织由细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、成纤维细胞、间充质基质细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、成骨细胞和（或）软骨细胞组成。实体瘤组织中的肿瘤基质发生巨变，肿瘤基质被激活及纤维化。癌症患者对抗癌治疗的反应情况也较大程度上取决于基质活化的程度。肿瘤基质活化及纤维化程度越高，抗癌治疗的效果往往越差［24］。

肿瘤间质可通过3 种方式限制抗肿瘤药物进入靶组织：间质纤维化、高间质压力以及间质酶对药物的降解。在肿瘤周围和整个肿瘤中形成的刚性ECM（纤维化）构成一种物理屏障，减少免疫治疗及靶向药物向癌细胞扩散；高密度的ECM 还能降低血管密度，导致血管嵌入基质，形成药物无法灌注的坚固屏障。此外，癌细胞还可以强烈黏附ECM 蛋白以逃避各种抗肿瘤治疗方法，此过程被称为细胞黏附介导的耐药性。与正常的组织相比，恶性肿瘤中间质压力明显升高，间质压力的升高亦会影响免疫治疗及靶向药物的扩散和传播［24］。

由癌症相关基质细胞（cancer-related stromal cells，CASCs）诱导的纤维结构成为肿瘤环境中细胞外基质屏障形成的主要原因［25］，包括胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌在内的许多恶性实体肿瘤的基质均会发生纤维化，不仅可以阻止CAR-T细胞的迁移，还可会影响其他化疗药物和分子靶向药物的传递［26-27］。其中，ECM还能捕获CAR-T细胞［28］，使CAR-T细胞局限于细胞外基质中，无法进一步与肿瘤细胞接触并发挥杀伤作用。细胞外基质中含有大量的硫酸类肝素蛋白多糖（heparan sulphate proteoglycans，HSPGs）［29］，而CAR-T细胞完全缺少分解HSPGs所需的肝素酶。因此，CAR-T细胞尚无法治疗含有丰富ECM的实体瘤。

实体瘤的基质中往往还缺乏或下调CAR-T细胞迁移所必须的趋化因子，如选择蛋白-P［30］、VCAM-1和ICAM-1［28］，影响CAR-T 细胞的迁移作用，以及同源配体CXCL9 和CXCL10 的缺乏阻碍CD8+效应T 细胞和记忆性T淋巴细胞通过趋化因子受体的募集。

4.3 肿瘤微环境的抑制作用

实体瘤的肿瘤微环境相对于血液系统肿瘤微环境更为复杂，肿瘤微环境由于缺氧、营养物质含量不足以及代谢酸浓度过高，使CAR-T细胞无法增殖并产生细胞因子，从而更难以浸润到实体瘤的内部。肿瘤微环境中还缺少自噬过程和应激反应激活时所必须的氨基酸，如色氨酸、赖氨酸和精氨酸等均影响CAR-T细胞在实体瘤治疗中的效果［19］。同时，实体瘤的微环境中还富含Tregs和MDSCs，其能够分泌TGF-β、IL-10、吲哚胺2，3-双加氧酶［31］等，使实体瘤的微环境整体呈抑制性因子高表达，不仅抑制CAR-T细胞及其他免疫细胞的迁移，还影响其抗肿瘤的活性。活化的Tregs可通过快速吸收IL-2直接清除过量的T细胞，导致针对肿瘤的CAR-T细胞数量不足［32］。

5 克服CAR-T细胞归巢障碍的研究进展

5.1 区域性过继CAR-T细胞治疗

目前，CAR-T 细胞治疗肿瘤通常采用静脉注射的方式输注进体内，但由于实体瘤具有许多抗CART细胞迁移的屏障，使得通过静脉注射入实体瘤患者体内的CAR-T 细胞大多存在于外周循环，仅少部分的CAR-T细胞能够浸润到实体瘤内并起到杀伤肿瘤细胞的作用。为了解决上述问题，Katz等［33］采取区域性过继CAR-T细胞，即根据实体瘤产生的位置，选择适当的部位或血管局部注射CAR-T 细胞，对肝及胰腺恶性肿瘤患者采用经皮肝动脉灌注具有核素标记的抗CEA 抗原的CAR-T 细胞，经MRI 检测后发现通过这种区域性过继给药途径的CAR-T细胞可以在肝内存活超过120 h，并且仅20%CAR-T 存在于外周循环，其余近80%CAR-T 细胞存在于肝脏及周围组织中。观察患者用药后反应发现，由于区域性过继给药能使CAR-T 细胞大多数聚集在病灶周围，因此与静脉注射组患者比较不仅疗效更加显著，而且其出现不良反应的比例更小且更轻，在最大耐受剂量下未出现4级或5级不良事件。

有研究提示［34］，靶向间皮素的CAR-T 细胞出现在恶性胸膜肿瘤中的区域传递效应中，与静脉注射CAR-T 细胞相比，胸膜内注射靶向间皮素抗原的CAR-T细胞可以改善T细胞的活化、持久性以及肿瘤反应。1 例颅内及脊髓转移的多形性胶质母细胞瘤患者经颅内注射IL-13Rα2-CAR-T 细胞后，生存期延长7.5个月［35］。

CAR-T细胞治疗实体瘤的过程中产生的不良反应多为CAR-T细胞无法准确到达实体瘤所在部位所致。因此，这种区域过继性的给药途径除了能够使CAR-T 细胞更有效地到达实体瘤部位、强化治疗效果外，还可降低治疗过程中的不良反应。

5.2 针对趋化因子和细胞因子改良CAR-T细胞

Gunassekaran 等［36］在用细胞毒性T 细胞（cytotox⁃ic T cells，CTLs）治疗黑色素瘤时发现，CTLs归巢的效果不佳，并且黑色素瘤中IL-4 受体（IL-4 receptor，IL-4R）普遍上调。充分利用黑色素瘤的这种特性，采用膜锚定的方法将IL-4 受体结合多肽（IL-4R Pep-1）固定于CTLs表面，结果发现与对照组CTLs相比，IL-4R 靶向CTLs 对黑色素瘤细胞具有更高的结合能力。并且还具有更快、更强的杀瘤效应，这种增强的效应包括细胞因子分泌增加、对黑色素瘤细胞的细胞毒性增强，以及增强M2 型巨噬细胞向M1 型巨噬细胞的再编程。此外，IL-4R 靶向CTLs 能有效抑制黑色素瘤生长，逆转免疫抑制的肿瘤微环境。上述研究结果表明，以IL-4R 为靶点的非基因工程CTLs 具有作为黑色素瘤过继T 细胞治疗的潜力，该方法可作为改良CAR-T 细胞的参考。除IL-4R 以外，有研究还发现在霍奇金淋巴瘤中使用CCR4表达的CD30特异性CAR-T细胞，以及在神经母细胞瘤中使用CCR2b 表达的gd2 特异性CAR-T 细胞［37-38］等经过趋化因子受体修饰过的CAR-T细胞在体内具有更强的肿瘤定位和抗肿瘤效果。

Hu 等［39］研究发现，IL-12 联合阿霉素在TILs 或CAR-T 细胞输注前协同给药可促进CD8+T细胞在不同的人异种移植瘤模型中的增殖能力，并可减少Tregs的浸润，增强肿瘤微环境中CAR-T 细胞的杀瘤效果，使用小鼠肺癌模型及乳腺癌肺转移的移植瘤模型验证该方法的效果，结果证明IL-12联合阿霉素能够增加实体瘤内CD8+T细胞的数量及穿透深度，加强抗NKG2D+的CAR-T 细胞在大型实体瘤模型中的疗效。

5.3 针对肿瘤基质改良CAR-T细胞

在实体瘤周围及肿瘤细胞间的细胞外基质和内皮下基膜中含有大量CAR-T 细胞无法分解的HSP⁃Gs，极大地影响CAR-T 细胞的穿透能力。为解决上述问题，Caruana等［40］在CAR-T细胞中加入一段能够生成肝素酶（heparinase）的基因，在CAR-T 细胞内合成能够分解肿瘤细胞间HSPGs 的肝素酶，进而增加CAR-T细胞的穿透能力。

CASCs 为肿瘤周围的正常基质细胞。其分泌各种细胞因子、生长因子和趋化因子，有助于肿瘤的增殖和转移。成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activa⁃tion protein，FAP）为一种丝氨酸蛋白酶，在上皮来源肿瘤的CASC 中高表达并促进肿瘤发生。部分学者针对肿瘤基质的该特性设计出抗FAP 的CAR-T 细胞，其中Kakarla 等［41］在研究中发现，抗FAP 的CART细胞具有较好的抗肿瘤反应且无明显的不良反应，Schuberth 等［42］在腹膜内异种移植模型中应用抗FAP的CAR-T细胞治疗也显示出较好的效果。

5.4 其他改进方法

为解决实体瘤中的肿瘤细胞表面特异性抗原表达缺乏，以及实体瘤周围基质的屏障作用，Celyad 公司开发出一款新的非基因编辑的通用型技术平台-CYAD-01。这种新型的CAR-T细胞表面有识别完整NKG2D受体。NKG2D为人类固有的免疫激活受体，主要由NK 细胞表达，但也表达活化的CD8+T 细胞、NK-T细胞以及一些CD4+和γδ+T细胞亚群［43］，其功能为识别和杀死被感染或癌细胞。临床前研究表明，CYAD-01 可直接识别肿瘤细胞，还可以靶向肿瘤基质、血管以及免疫抑制性肿瘤微环境内表达NKG2D配体的非肿瘤细胞，从而破坏肿瘤细胞生存和生长所需的必要支持［44］。

6 结语

综上所述，CAR-T 细胞在治疗肿瘤方面极具潜力，但在实体瘤治疗方面仍存障碍。在治疗血液系统肿瘤方面CAR-T 细胞已取得较好的疗效，但在治疗实体瘤治疗方面CAR-T 细胞起步较晚。因此，提高CAR-T细胞在治疗实体瘤方面的疗效及降低不良反应为研究要点。实体瘤复杂的肿瘤微环境以及实体瘤的屏障作用给CAR-T 细胞的杀瘤造成巨大阻碍，但随着CAR-T细胞治疗实体瘤研究的不断进展，CAR-T 细胞的杀瘤活性、持久性以及归巢能力不断地增强，并在许多实体瘤方面已取得进展。在临床肿瘤治疗方面，CAR-T 细胞治疗或CAR-T 细胞联合放化疗有望成为新的一线治疗方法。