精准医学时代骨肉瘤诊疗的研究进展*

陈祉璇 姜亚飞 华莹奇 蔡郑东

骨肉瘤多发于儿童和青少年，约占儿童癌症的3%～5%和成人癌症的1%，是最常见的骨骼系统原发性恶性肿瘤［1］。自20世纪70年代至今，手术切除和药物化疗一直是骨肉瘤的主要治疗手段，患者总体生存率停滞于60%左右［2-3］。骨肉瘤的样本量小和基因异质性使骨肉瘤分子分型面临很大挑战［2］，而组学技术和大数据技术可有效解决这两大困难。因此，将精准医学应用于骨肉瘤治疗是值得探索的研究方向。本文对基于基因组学、源自患者的异种移植模型（patient derived xenograft，PDX）测序、肿瘤免疫治疗的骨肉瘤精准医学的研究进展作一系统综述。

1 精准医学的定义

精准医学是根据患者在基因组、表型、生物标志物和心理社会上的特征，为患者定制治疗方案的医疗模式［4］。2015年1月美国建立通过共享信息-搭建知识网络-重新定义疾病分类的方式提高诊断精确度和治疗效果的重要目标［5］。组学技术和大数据技术是精准医学的基础。综合运用基因组学、表观蛋白质组学、代谢组学等生物医学分析技术可更全面、更准确、更深入地反映疾病的本质特征，有助于对肿瘤患者进行风险评估、类别诊断和治疗策略制定［6-7］。另外，利用超级计算机解读大量组学信息，有助于解决肿瘤的基因组异质性、原因不明的耐药性和药物组合等难题［7-8］。

2 基于基因组学的骨肉瘤精准医学的探索

2.1 基于纯基因组测序的骨肉瘤精准治疗的探索

2.1.1 PI3K信号通路的突变 Perry等［3］利用全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、全外显组测序（whole exome sequencing，WES）、RNA测序方法，在24%骨肉瘤样本中发现了PI3K/mTOR通路的基因突变；又因人骨肉瘤（human osteosarcoma，HOS）细胞系普遍对PI3K/mTOR抑制剂高度敏感，研究者甚至认为基因突变是PI3K/mTOR通路活化的唯一途径。另外，PTEN、TSC2、NF1、PI3KCA、PDPK1、AKT1、EIF4B等PI3K/mTOR通路相关基因也常发生突变。将小鼠的TP53和RB1基因敲除后可得到小鼠原发骨肉瘤模型，此模型也存在PTEN和PI3KR1的突变［3］。骨肉瘤细胞系的全基因组表达谱和蛋白激酶谱进一步证实了PI3K/Akt通路的过度激活［9］。PI3K/mTOR通路的活性可被药物（如PI3K/mTOR双重抑制剂BEZ235、PIK3CA选择性抑制剂PIK75、雷帕霉素）或基因沉默抑制，从而抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡［3，10］。

2.1.2 IGF 信号通路的突变 胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是骨组织中最丰富的生长因子。成骨细胞分泌的IGF-1 可促进生长激素的分泌和细胞增殖，在维持肿瘤细胞生长中起重要作用［11］。

IGF1R 信号通路突变是约27%骨肉瘤的驱动基因突变；通路中IGF 突变存在于7%的骨肉瘤中，IGF1R 扩增存在于14%的骨肉瘤中。IGF1R 的胞内定位是骨肉瘤分子分型的有效诊断工具，限于核内的IGF1R 可提示此类骨肉瘤患者能获益于IGF1R 抑制剂［11-12］。据此可推测，IGF-1R 单克隆抗体R1507、robatumumab、阻断IGF-1 信号通路的chimaphilin、leptocarpin等药物对此部分患者有更好的疗效［13-16］。

2.1.3 BRCA 缺失样突变 BRCA1 和BRCA2 是重要的抑癌基因，参与DNA双链的断裂修复；其突变易导致染色体的不稳定性，在乳腺癌等癌症的发生发展中起重要作用［17］。

31个骨肉瘤的WES结果显示，通过碱基突变、杂合性丢失等机制，80%以上骨肉瘤存在BRCA1/2缺失样突变、平均1 个骨肉瘤发生17 个BRCA 基因突变，提示不同的单基因突变（如TP53、RB1、MUTYH 等）可能使骨肉瘤分化为不同亚群，进而随机激活BRCA1/2 的体细胞拷贝数突变（somatic copy number alterations，SCNAs）［18］。多个骨肉瘤细胞系对乳腺癌治疗药物talazoparib 敏感，敏感度与其BRCA 特征突变呈正相关。发生BRCA1/2 双突变的细胞系（如MG63、ZK-58、SaOS-2 和MNNG/HOS）对talazoparib敏感；而发生BRCA2单突变的细胞系（如U2OS）则对talazoparib 抵抗［19］。以上结果表明，BRCA 缺失样突变对骨肉瘤的分子分型和药物选择具有重要意义。

2.1.4 其他突变 VEGF 是血管发生和形成的重要信号蛋白［20］。VEGF 的过表达和VEGFR1 自分泌、VEGF-A 基因扩增等有关，对骨质溶解、血管生成和骨肉瘤的增殖转移至关重要［21］。基因测序结果显示，约23%的骨肉瘤存在VEGF-A 基因扩增，VEGFA/VEGFR2抑制剂对此类患者疗效显著［22］。

RANKL 是调控骨新陈代谢的重要膜蛋白。RANKL/RANK的过度激活可促进破骨细胞对骨质的破坏，激活骨改建和骨肉瘤增殖的恶性病理循环。阻断RANK/RANKL信号通路不仅可以抑制骨肉瘤的增殖和转移［23］，甚至可以预防过表达RANKL 小鼠的骨肉瘤的发生［24］。

RECQL4 是DNA 同源重组修复中的重要解旋酶［25］。虽然RECQL4 的缺失和突变均可造成基因组的不稳定性和细胞衰老［26］，但仅RECQL4突变的小鼠易发生骨肉瘤，而RECQL4完全缺失的小鼠仅存在骨骼发育不良或骨质疏松［27］。进一步研究表明，REC⁃QL4调节骨骼发育的机制与p53的活性有关，但目前其具体分子机制尚不明确［28］。

细胞周期调控基因的突变在骨肉瘤中普遍存在，如75%骨肉瘤存在TP53 突变［3］，61%骨肉瘤存在RB1 突变［3］，56%骨肉瘤存在TP53 和RB1 的双重失活［29］。其常作为骨肉瘤的驱动基因突变，在骨肉瘤的发生发展中发挥不同的作用。其中，p53、Notch、Myc突变可引起GEMM骨肉瘤发生，Rb1和Pten突变则加速肿瘤的发生和增殖。骨肉瘤的染色体重组模式、潜伏期长短、转移速度、预后情况等和驱动基因突变的种类和数量密切相关，然而驱动基因突变与骨肉瘤的分化方向之间未见相关性，靶向p53的药物也需要进一步研究和开发［29］。

2.2 基于PDX测序的骨肉瘤精准治疗的探索

源自患者的PDX是将患者的肿瘤细胞植入免疫缺陷的小鼠从而建立肿瘤模型。PDX 较体外细胞系具有大量优势，如体外细胞系无法展现肿瘤、基质、其他细胞的相互作用；PDX 能更准确地预测异质性骨肉瘤对药物的反应；体外细胞系仅筛选出有效杀死肿瘤细胞的药物，而PDX 能筛选出有效杀死或抑制肿瘤生长的药物［30］。因此，PDX 对骨肉瘤的治疗和研究具有重要意义。

2.2.1 PDX 保持原发肿瘤的遗传特性和异质性 由于PDX可重现人体内的肿瘤微环境，且其基因突变、基因表达和治疗反应与原发肿瘤高度一致［31］，因此PDX 能更准确地预测异质性骨肉瘤对药物的反应，是高通量药物筛选的重要工具［32］。

在分子层面上，PDX 与原发肿瘤均上调扩增基因和核糖体蛋白基因的表达［22］，表达相同的特征性组织学亚型mRNA［33］，表达一些相同的胞外分子。如PDX 的血液中存在人类的DKK-1，其浓度和骨肉瘤的增殖速率呈正相关，其抗体BHQ800可抑制骨肉瘤的生长和转移［34］。

在细胞层面上，PDX 与原发骨肉瘤的细胞特征一致：如粗面内质网（rough endoplasmic reticulum，RER）肥大，绒毛状细胞表面，相同的生长、侵略、转移模式，相似的去分化程度和药物反应［32，35］。PDX的体外高通量药物筛选结果显示，骨肉瘤细胞对HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂、PI3K/mTOR 组合抑制剂、PI3K/MEK 组合抑制剂较敏感，而对RAF1、MAPK、MAP2K 抑制剂较不敏感［32］。Igarashi 等［36］在顺铂抗药性PDX 上进行药物筛选，结果显示联合使用替莫唑胺和曲贝替定也许可以抑制抗顺铂骨肉瘤的增殖。此外，PDX 的细胞同样存在基因异质性。同一骨肉瘤患者的PDX 和源自患者的细胞系（patient de⁃rived cell-line，PDC）单核苷酸多态性阵列（single nu⁃cleotide polymorphism array，SNP array）结果显示，虽然PDX 和PDC 的染色体均发生大面积重复和缺失，但两者染色体异常情况并不完全相同。因此，PDX中可能存在不同的细胞亚群，而PDC 仅反映其中一个亚群的基因组情况［33］。

2.2.2 PDX 和原发肿瘤基因拷贝数对比 鉴于PDX和原发肿瘤的一致性是PDX 临床转化的基础，而基因拷贝数是验证两者一致性的重要方面，因此结合基因组学数据和PDX实验结果很可能有助于个体化药物的筛选。

WGS结果显示，可靶向的SCNAs存在于93%的骨肉瘤中，且在PDX中稳定存在。PDX的体内药物靶向实验表明，特异性靶向患者SCNAs的药物疗效较好，而非靶向SCNAs的药物疗效较差。其中，MYC扩增的PDX（39%）对CDK抑制剂AT7519敏感，FOXM1扩增的PDX（11%）对哌柏西利敏感，AURKB扩增的PDX（13%）对AURKB抑制剂AZD1152敏感，CCNE1（33%）扩增的PDX对CDK抑制剂dinaciclib敏感［22］。

2.3 免疫治疗在骨肉瘤精准治疗中的应用

肿瘤免疫治疗指通过激活免疫系统、提高抗癌能力来治疗癌症，具有特异性和持久性等特点［37］。由于肿瘤具有高度遗传异质性、肿瘤细胞和免疫细胞复杂的相互作用，肿瘤免疫疗法需要综合分析宿主和肿瘤因素，需要明确肿瘤的分子特征和免疫细胞亚群的功能［38］。

2.3.1 免疫检查点在骨肉瘤中的应用 免疫检查点是抑制免疫应答的信号通路，PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80、CTLA-4/CD86，在正常机体中维持自身耐受、调节免疫强度。然而，免疫检查点与肿瘤的免疫逃逸密切相关；阻断免疫检查点的信号转导可有效增强抗肿瘤免疫应答［39］。T 细胞上的主要抑制性受体是CTLA-4和PD-1，是肿瘤免疫逃逸的重要途径，成为治疗许多晚期肿瘤的新有效靶点［40］。

骨肉瘤的免疫检查点突变同样呈基因异质性。PDL1/PD-L2、B7-H3和IDO1的基因扩增频率在患者间差异显著，且仅部分原发肿瘤（13%）、复发肿瘤（25%）和转移肿瘤（48%）表达PD-L1［41］，表达程度从从阴性至高度表达不等［42］；然而，PD-L1和PD-L2的扩增频率在患者个体内高度相关［43］。进一步研究显示，PD-1与免疫通路的活化、肿瘤转移相关信号、多西他赛的耐药性呈正相关；PD-L1与免疫通路的活化、RAS通路的活化、肿瘤转移相关信号、顺铂的抗药性呈正相关；PD-L2与免疫通路的活化、促凋亡信号呈正相关，但与干细胞、DNA修复、多柔比星抗药性呈负相关［44］。

同一患者的原发病灶和转移病灶中PD-L1表达差异显著。PD-L1一般仅在转移病灶中表达而不在原发病灶中表达；相似地，细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）仅在转移病灶中表达PD-1，而不在原发病灶中表达PD-1［45］。靶向药物实验证实，PD-1的单克隆抗体可提高肺部CD8+T细胞的浸润和毒性［44］。然而，有研究发现PD-L1单克隆抗体单一用药无长期疗效，α-CTLA-4 mAb和α-PD-L1 mAb联合用药有长期疗效，可能与用药过程中肿瘤细胞下调PD-L1的表达并上调CD80/CD86的表达，CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）下调PD-1的表达并上调CTLA-4的表达有关［46］。另外，鉴于PD-L1的表达与T细胞的高度浸润有关，推测转移性骨肉瘤患者更可能获益于基于T细胞的免疫治疗［41-42］。

2.3.2 肿瘤疫苗在骨肉瘤中的应用 肿瘤疫苗是使免疫细胞识别肿瘤抗原（包括完整的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解产物和肿瘤相关肽段等）和主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC），从而激活免疫系统的免疫疗法，是最早的肿瘤免疫疗法之一［47］。

然而，肿瘤疫苗在骨肉瘤中效果较差。定制肽段疫苗（personalized peptide vaccination，PPV）临床试验显示，虽然疫苗提高了患者CTL、免疫球蛋白G（immu⁃noglobulin G，IgG）的浓度，但未提高患者的总生存率［48］。考虑到肿瘤相关肽段激活的免疫应答强度有限，有研究尝试以病毒或细菌作为肿瘤疫苗的载体，如Mason等［49］使用HER2的李斯特菌疫苗（Listeria monocytogenes，Lm）和Domingo-Musibay等［50］使用的由CD46侵入细胞的麻疹病毒疫苗。虽然以细菌或病毒为载体的肿瘤疫苗的确能激活相对强烈、持续的肿瘤免疫反应，但感染隐患使其始终停留在试验阶段。

总体而言，大多数肿瘤疫苗疗效轻微，可能与骨肉瘤细胞下调MHCⅠ分子的表达、缺少特定的基因转位和融合模式有关；肿瘤疫苗可作为辅助疗法，提高化疗、放疗、免疫检查点抑制剂等的疗效［47］。

2.3.3 免疫细胞改造在骨肉瘤中的应用 嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CART）治疗是将抗体的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFV）和T 细胞受体（t cell receptor，TCR）胞内信号域的嵌合蛋白表达于T细胞表面，使T细胞直接识别肿瘤抗原并产生免疫应答［51］。为保证CAR-T治疗的有效性和安全性，其靶向的抗原需在骨肉瘤中高表达，且在正常组织内不表达［52］。如靶向IL-11Rα、HER2、IGF1R 和ROR1 的CAR-T 均可抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移，且不造成严重的器官毒性［53-55］。然而，由于骨肉瘤的高度异质性和其恶劣的肿瘤微环境等因素，骨肉瘤的CAR-T 治疗仍需不断探索和改进，如联合免疫检查点抑制剂治疗［56］。

3 结语

随着组学和大数据技术的日趋成熟，恶性肿瘤的分子机制逐渐被揭示，肿瘤的分子分型被不断细化和完善。最新的研究揭示，对于高度基因异质性的骨肉瘤，药物的疗效和其靶向突变基因的特异性高度相关，这一发现进一步证实了精准定位基因缺陷、精准靶向用药的重要性，有望弥补传统治疗手段靶向性不足的缺陷，提高患者的生存率和生存质量。陆续开展的骨肉瘤基因组、转录组、蛋白组研究筛选出许多骨肉瘤相关突变，为开发相应的靶向治疗药物指明了方向，推动了骨肉瘤的精准治疗的发展，具有可观的临床转化前景。