彝族高血压患者MTHFR C677T基因多态性及其与血压、同型半胱氨酸水平的关系

农 茜 陆文权 潘兴寿 李天资 韦宝敏 杜红蕾 黄小洧 梁 烨▲

1.广西壮族自治区那坡县人民医院，广西那坡 533999；2.右江民族医学院附属医院，广西百色 533000

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是甲硫氨酸（MET）在分解代谢中产生的活性甲基供体循环代谢重要的限速酶，MET 通过S- 腺苷甲硫氨酸（SAM），S- 腺苷同型半胱氨酸（SAH）和同型半胱氨酸（HCY）代谢途经中提供活性甲基。目前认为基因突变可导致血浆同型半胱氨酸（HCY）水平增高，加重患者脑卒中的患病风险。为了解彝族高血压患者MTHFR C677T 基因多态性的分布特征及其与血压，HCY 水平的关联性，课题组于2018 年10月随机收取122 例彝族高血压患者，检测其收缩压，舒张压，HCY 和MTHFR C677T 基因位点，并与110例彝族非高血压居民比较，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018 年10 月在广西百色市那坡县开展慢性病调查中发现的高血压患者中随机选取122 例彝族高血压患者（高血压组），检测其收缩压，舒张压，HCY和MTHFR C677T 基因位点，并与110 例彝族非高血压者（对照组）比较。高血压组男75 例，女47 例，对照组男59 例，女51 例，两组性别比较差异无统计学意义（χ2=1.457，P＞0.05）。高血压组平均年龄为 （48.2±12.4）岁；对照组为（46.4±13.2）岁，两组年龄差异比较无统计学意义（t=1.071，P＞0.05）。具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血压测量方法 测量血压用汞柱血压计，受检者取坐位右前臂测量，测量前不吸烟、饮酒、浓茶或咖啡，不作剧烈运动，保持安静休息≥30min。平坐5min 后行血压测量，每例受检者连续测量3次，每次间隔≥120s，取三次血压计数的平均值为血压值。平均收缩压≥140mm Hg 或平均舒张压≥90mm Hg 或已确诊为高血压患者[7]。

1.2.2 用于PCR 检测的血液标本采集与处置 （1）抗凝剂用柠檬酸抗凝液（右旋葡萄糖1.47g，柠檬酸0.48g，柠檬酸钠1.32g，加H2O 至100mL）。采集受检者外周静脉血3mL，置于存有0.5mL 柠檬酸抗凝液的冻存管中，置于0℃冰箱保存40h 后转-70℃冰箱贮存。（2）基因组DNA 提取：用EDTA 抗凝管采集受检者外周静脉血3mL，置于20℃室温2h，严格按照QIAamp DNA Blood Maxi 试剂盒说明书操作。

1.2.3 用于HCY 检测的血液标本采集与处置 受检者禁食≥10h，于早晨6：30 ～9：30 采取坐位，用EDTA 抗凝管抽肘静脉血5mL，以3000r/min离心10min，取血浆置-30 ℃冻存备查。 用日立HITACHI 7600-020 ISE 全自动生化仪（HITACHI公司生产，由杭州联川生物技术有限公司提供）循环酶法检测血浆HCY 水平。

1.3 主要仪器与试剂

美 国Bio-Rad PTC-200 PCR 仪（Bio-Rad Laboratories公司生产，由天津伟思实验仪器科技有限公司提供），3730XL 测序分析仪和POP-7TM高分子聚合物[Applied BiosystemsTM公司生产，由赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供]，Gel Doc XR+ BIO-RAD全自动凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories 公司生产，上海艾研生物科技有限公司提供），超微量分光光度计NanoVue（GE Healthcare 公司，广州市龙煜生物科技有限公司由提供），DYCP-34A 琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司生产，由天津伟思实验仪器科技有限公司提供）。ABI 3100 全自动序列分析仪（美国ABI 公司）。主要试剂：QIAamp DNA Blood Maxi 血液基因组DNA 提取试剂盒（德国QIAGEN 公司生产，由广西根辽生物技术有限公司提供），Premix Ex TaqTMVersion 2.0（Loading dye mix 生产，广西助研基因科技有限公司提供），Tris- 硼酸盐-EDTA（Tris-borate-EDTA），powder（TAKARA 公司生产，广西助研基因科技有限公司提供）。

1.4 基因扩增与鉴定

基因型鉴定采用PCR-RFLP 法：参见文献[8]。引物由杭州联川生物技术有限公司合成。MTHFR C677T 的SNP 上游引物序列为5’- CCG AAG CAG GGA GCT TTG -3’，下游引物序列5’- AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG -3’。反应条件为： 94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s， 72℃延伸45s，30 个循环扩增，随后72℃延伸5 min。4% 琼脂糖凝胶电泳判断酶切结果：纯合野生型C/C 仅有一条198bp 条带；纯合突变型T/T 可被酶切为175bp和23bp 2 个条带；杂合子C/T 应包括198bp、175bp和23bp 3 个条带。

1.5 统计学处理

数据用SPSS20.0 软件处理，应用HaploView 4.2软件进行单核甘酸多态性的Hardy-Wein-berg平衡分析。对全血和基因组DNA 的MTHFR C677T 基因型检测方法进行Kappa一致性检验。计量资料正态或近似正态分布资料以（）表示，两组间比较用t检验；三组间比较用方差检验，两两比较用q检验；计数资料用χ2检验。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高血压组与对照组血压和HCY水平分布特征比较

高血压组收缩压，舒张压和HCY 平均水平均高于对照组（P＜0.01）。见表1。

表3 彝族高血压患者MTHFR C677T 不同基因位点与血压和HCY水平比较

组别 分型 n 收缩压（mm Hg） 舒张压（mm Hg） HCY（µmol/L）高血压组 CC 15 145.40±14.06 89.80±5.54 21.68±7.22 CT 58 148.07±17.64 92.76±9.10 23.60±8.54 TT 49 156.08±14.33 99.35±10.63 29.40±6.63 qTT组与CC组比较PTT组与CC组比较qTT组与CT组比较10.682 9.547 7.716 0.025 0.001 0.001 2.669 2.959 2.913 0.033 0.024 0.018对照组 CC 35 116.43±12.12 73.66±8.43 13.29±7.33 CT 59 117.64±14.62 74.22±8.61 15.20±8.31 TT 16 121.13±16.15 76.75±11.32 19.05±8.71 PTT组与CT组比较qTT组与CC组比较PTT组与CC组比较qTT组与CT组比较4.696 3.093 5.758 0.273 0.257 0.001 1.215 0.563 1.903 0.687 0.770 0.272高血压组与对照组比较 tCC PTT组与CT组比较PCC tCT PCT tTT PTT 7.382 6.792 3.725 0.000 0.000 0.002 6.336 6.861 3.249 0.000 0.000 0.003 27.958 6.584 4.111 0.000 0.000 0.000

2.2 高血压组与对照组MTHFR C677T基因位点CC、CT、TT型频率和等位基因频率分布比较

高血压组MTHFR C677T 基因位点TT 型频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），高血压组MTHFR C677T 位点T 等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3 高血压组与对照组MTHFR C677T基因位点不同类型与血压和HCY水平比较

在高血压组中，TT 型患者收缩压平均水平高于CC型，也高于CT型，差异有统计学意义（P＜0.05）；TT 型患者舒张压平均水平高于CC 型，也高于CT型，差异有统计学意义（P＜0.05）。在对照组中，CC、CT 和TT 三组收缩压和舒张压平均水平， 差异无统计学意义（P＞0.05）。在高血压组中，TT 型的HCY 平均水平高于CC 型，也高于CT 型，差异有统计学意义（P＜0.05）。在对照组中TT 型的HCY 平均水平高于CC 型，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组CT 与CC 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨论

本地区的社会经济正在步入高速发展的势头，不断改善彝族居民的衣食住行，随着生活水平得到极大的提高，在这种情况下，如果健康知识的宣教不能到位，势必冲击彝族居民的健康，慢性疾病的患病率会出现大幅度攀升，应当做好提早防备[9]。研究表明，经济快速增长的地区，居民或从农村迁向城市，或从农业转向工业、商业或服务业，经济收入提高，膳食急速改变，幸福感觉增高，但是心理压力，精神紧张也在增加[10]，同时体能锻炼比较少，居民高血压的患病率也在快速增长[11]。

彝族是第六大少数民族人口，2010 年第六次全国人口普查数据显示，彝族人口有870 多万人，主要居住在四川，云南，贵州和广西的高原或丘陵地区。独特的饮食居所、通婚制度、服饰装束、山歌舞蹈、宗教信仰和礼仪节日等是彝族居民典型的文化特征[11]。近期的研究报道表明，彝族高血压患病率较其他民族低，其原因还不完全清楚[12]。

本组资料显示，彝族高血压患者MTHFR C677T基因位点TT 纯合子突变携带者其收缩压，其舒张压和HCY 水平高于CC 和CT 基因型。彝族非高血压者MTHFR C677T 基因位点TT 纯合子突变携带者HCY 水平高于CC 基因型， 其MTHFR C677T 不同基因型收缩压，舒张压水平没有多大差别。彝族高血压患者MTHFR C677T 基因TT 纯合子突变频率比较高，MTHFR C677T 基因TT 纯合子突变者其收缩压，舒张压和HCY 水平高于CC 野生纯合子、CT 杂合子。与国内报道的相同或相似之处[13-21]，《中国高血压防治指南2010》指出HCY ≥10µmol/L 为新的心血管危害要素，同时将伴有高同型半胱氨酸血症（HHCY）的高血压定义为H 型高血压。MTHFR C677T 基因TT 纯合子突变是MTHFR 基因第677 位点上的胞嘧啶变成胸腺嘧啶，其编码的蛋白质MTHFR 的第226 位点上的丙氨酸变成缬氨酸，突变生成的MTHFR 耐热性降低，酶活性下降，严重影响机体甲基化的反应循环，阻碍HCY 转变为甲硫氨酸的速率，产生HHCY。

流行病学调查表明，MTHFR C677T 突变和HHCY 是血管疾病比较明显的影响因子，与脑卒中的发生紧密相关。早期发现并给予干涉，对防控脑卒中有重要作用。中国脑卒中一级预防研究（CSPPT）认为，脑卒中的主要危险因素不仅仅是高血压，还应当包括HHCY、血脂异常，肥胖，高血糖和血小板功能异常等，研究认为高血压与HHCY 的干预对防控脑卒中效果不错[22-23]。

本项研究提示MTHFR C677T 基因位点TT 纯合子突变与血浆HCY 高水平有关联。当然我们也应当明白，影响机体HCY 水平的因素是比较多的，除了MTHFR C677T 基因位点TT 纯合子突变以外，还有蛋氨酸来源过多，叶酸、维生素B6、维生素B12缺乏等营养因素，还有慢性肝病，酒精性肝炎，另外年龄、抽烟和某些药物等均可引起血HHCY。对于彝族高血压患者预防与控制，应当针对不同的人群，采取不同的防治措施，才能提高防治效果。彝族居民在生活环境相差不大的条件下，其高血压患病率能够保持比较低的水平，与其优秀的传统文化生活习惯紧密相联，值得我们深入的研究和传承。