Exosomes在骨代谢疾病中作用的研究进展

高坤 朱文秀 李全 李亨 余伟吉 王立新 曹亚飞*

1.深圳市中医院骨伤科，广东 深圳 518000 2.北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518100

骨代谢疾病尤其是骨质疏松症是高发的老年疾病之一，严重影响老年人的生活质量，但其发病机制尚未完全明确。骨代谢过程中成骨细胞和破骨细胞扮演重要的角色。调节成骨细胞和破骨细胞在分化矿化方面的平衡是治疗类似于骨质疏松症的系统性骨代谢疾病的先决条件[1]。成骨细胞和破骨细胞之间存在信息交流机制，该机制错综复杂，大量的信号分子、细胞因子参与调控。深入研究不同信号分子的调控作用对于骨代谢疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义。

外泌体(Exosomes)是细胞内部的胞内体与细胞膜融合释放到细胞外，直径大小为30～120 nm的膜性囊泡[2]。在过去的几年中，这些纳米级别的颗粒已经在癌症进展、免疫应答、药物载体的研究方面取得了显著的成果，但在骨代谢疾病方面研究匮乏。Exosomes可以转运基因物质以进行细胞与细胞之间的交流，能够从新的角度揭示疾病的发病机制，从而为疾病的诊断治疗提供新的思路。近期有部分研究人员对骨代谢相关Exosomes进行了研究，包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)等，取得了一些研究成果。因此，本文对Exosomes在骨代谢过程中的作用及角色进行总结及分析，以期能够对骨代谢疾病的基础研究和临床防治提供新的方向和参考。

1 Exosomes的定义

大部分的真核细胞都能分泌具有细胞间交流能力的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，这些不均匀封闭的膜结构具有影响临近和远处细胞的能力。根据起源及生物特性可以将胞外囊泡分为3类：凋亡小体(apoptotic bodies)、微粒(microvesicles)和外泌体(exosomes)[2]。1970年Rose Johnstone在网织红细胞中发现并首次提出Exosomes一词，然后Laulagnier等从细胞系中剥离到有蛋白酶活性的微粒。1990年之前，Exosomes一直被当作细胞代谢产物的运输体，直到β-cell分泌的Exosomes发现具有转运抗原的功能才被引起重视。其包含有大量的蛋白分子、DNA、RNA、mRNA及microRNA，能够通过细胞间的传递发挥重要作用。在肿瘤免疫调控、炎性通路调节、分子标志物、药物装载等方面研究及应用广泛[3]。

2 骨组织Exosomes的提取过程及成分组成

在Exosomes的研究中，为了能够更好地进行免疫实验、诊断标志物研究，或作为治疗和生存率的预测分子，其提取过程至关重要，不能在提取过程中降低其纯度和损失其生物活性[4]。目前很多的商业试剂盒能够对体液中Exosomes进行分离和富集，包括超速离心法、透析膜过滤法、磁珠分选法、流式分选法[5-7]，各种不同的收集方法都具有一定的优缺点[8]。超速结合差速离心是利用Exosomes密度进行分离的经典方法[9]，在血清、血浆、尿液等体液中应用广泛。在骨组织的研究中，骨细胞来源的Exosomes可以应用超速结合差速离心直接提取，而在骨组织内部的，如骨髓来源的Exosomes，则需要将骨髓先提取出来再进行下一步分离。光学方法是最常用来精准地观测Exosomes的运动的，最常用的光学方法是纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)，能够对液体样本内的Exosomes尺寸大小及密度进行测量。动态光散射(dynamic light scattering，DLS)也被用作测量骨来源的Exosomes的尺寸大小。DLS通过激光检测颗粒的布朗运动，分析悬浮粒子及其强度散射光的波动。电镜是被广泛应用于检测Exosomes特征的非光学的仪器。电镜的作用原理是在光学显微镜的基础上，用电代替光线从而产生图像。然而，由于电镜要在真空中进行，Exosomes的检测需要固定和脱水，而该过程会影响其尺寸及形态[10]。在软骨和骨膜内的近期研究中，研究者发现几个被转移的内源性的蛋白缺少胞外基质(extracellular matrix，ECM)的信号肽段。比较显著的就是两个ER常驻蛋白葡萄糖调节蛋白-78(glucose regulatory protin-78，GRP-78)和TGF-β受体II相互作用蛋白1(TGF-beta receptor II interacting protein1，TRIP-1)，这两个蛋白是定位于ECM而不含信号肽段[11]。骨髓间充质干细胞来源的Exosomes被明确鉴定的存在标志物蛋白CD9/CD63/CD81(27、28)。骨髓基质细胞来源的Exosomes则含有热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)、热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)、阀蛋白-1(flotillin-1)[12]。最近有研究用质谱检测了成骨细胞分泌的外泌体的1 536个蛋白，发现其中的172个蛋白与骨组织数据库中的蛋白重合[13]。更进一步通过蛋白质组分析，检测到蛋白包括ephrinB1蛋白(EFNB1)、转换生长因子受体3(TGFBR3)、脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)、骨形态蛋白受体1(BMPR1)、Smad泛素化调控因子-1(SMURF1)，这些蛋白在骨组织疾病中均有重要功能。除了蛋白，骨组织来源的Exosomes内各种的核酸也被鉴定出来[14]。有研究将骨髓间充质干细胞成骨分化过程中分泌的Exosomes内miRNA的不同进行了鉴定，发现let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、 miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p和miR-302b明显升高，miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a和miR-320c降低。进一步发现7个mRNA，包括RPS2、DGKA、ACIN1、DKK2、Xsox17、DDX6和Lsm2表达具有差异。

3 Exosomes在骨量丢失中的角色

骨组织是一个在成骨细胞促进合成、破骨细胞促进分解，协调进行的不断建模和修复的过程。成骨细胞与破骨细胞之间相互交流，交流过程复杂，牵涉到激素、生长因子、mRNA和miRNA。对骨组织中的Exosomes进行研究，发现Exosomes能够直接影响成骨细胞、破骨细胞和骨髓间充质干细胞以调控骨的结构及代谢。成骨细胞来源的Exosomes包含有骨调节蛋白，能够刺激破骨细胞的结构，是骨组织进行细胞间交流的机制之一。核因子Κβ配体活化受体(receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand，RANKL)隶属于TNF家族，在骨代谢的过程中有重要作用，能够调控破骨细胞的激活。成骨细胞分泌的Exosomes包含有RANKL，甲状旁腺激素能够促进RANKL的释放，携带RANKL的Exosomes能够进入破骨细胞内起到传递RANKL的作用[15]。有研究证实老年患者的Exosomes与年轻患者相比，更加能够抑制骨的生成，并且该抑制作用与半凝乳素蛋白(Galectin-3)相关[16]。Galectin-3在老年患者的Exosomes中减少，体外实验中Galectin-3的过表达能够引起BMSCs成骨分化能力的增强。骨化成骨细胞来源的Exosomes已经被证实包含有miRNAs，例如miR-1192、miR-680、miR-302a，这些Exosomes能够被BMSCs吞噬从而刺激成骨性分化。Exosomes激活BMSCs成骨分化的机制是Exosomes内的miRNAs能够激活Wnt/β-catenin通路[17]。Wnt/β-catenin通路是BMSCs分化的关键调控通路，而Wnt通路的激活能够抑制PPARγ、CCAAT增强结合蛋白的表达，激活成骨因子Runx2、Dlx5和Osterix的表达。

4 干细胞来源Exosomes在骨组织再生修复中的角色

在过去的几年，骨组织修复再生领域中Exosomes的作用被引起重视。干细胞分泌的Exosomes已经被用在几项再生应用中[18-19]。报道显示特异性蛋白、mRNA和miRNA能够从Exosomes中横向转移至临近或远处细胞以激活疾病组织中的再生程序[20]。Furuta研究显示间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)Exosomes是MSC旁分泌信号的重要分子之一。与对照组相比，注射MSC-exosomes能够增强骨折的愈合。最近，MC3T3-E1细胞来源的Exosomes被用来促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。该研究发现Exosomes明显影响受体基质细胞内的miRNA成分，并且这一改变是通过抑制Axin1的表达和增加β-catenin蛋白以激活Wnt信号通路[17]。Exosomes来源于干细胞和成骨细胞前体能够激活破骨细胞的形成。骨髓基质细胞来源的Exosomes已经被证实能够影响破骨细胞前体至破骨细胞形成的过程。因此，该类Exosomes能够被用在破骨细胞形成需要的组织中，例如正畸治疗和双膦酸盐相关的关节骨坏死[21]。Huang等[22]评估了体内外牙髓细胞来源的Exosomes引起幼稚人牙髓干细胞及人骨髓基质细胞牙源性分化的可能。该结果证实Exosomes能够被各种细胞内化，并且刺激牙分化所需基因的表达。更进一步，当检测牙髓干细胞的齿根切片模型时，Exosomes能够促进牙髓类似组织的再生[23]。Qi及其合作者利用干细胞来源的Exosomes去修复骨质疏松兔骨组织的缺损，证明Exosomes能够有效刺激骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并且该作用随着Exosomes浓度增加而增强。在体内Exosomes通过血管增生和骨生成以增强缺损的颅骨骨组织的再生。最近，人类胚胎间充质干细胞来源的Exosomes被用来治疗兔骨软骨缺陷[24]，第12周Exosomes处理后的缺陷展示出完整的软骨和软骨下骨，其表面光滑、具有完整形态。骨组织细胞来源的Exosomes能够通过成骨细胞分化和破骨细胞的下调，以促进骨组织修复和再生。

5 骨组织Exosomes内miRNA的研究

骨组织来源的Exosomes miRNA能够被用作成骨细胞分化和基质形成的靶点。有研究对骨形成过程中牵涉的Exosomes miRNA进行了分析。骨化细胞来源的Exosomes中的miRNAs中有4个是高表达的，即：miR-677-3p、miR-680、miR-3084-3p和miR-5000。Let-7蛋白在成骨细胞前体和分化成熟内Exosomes均可以被发现，并且能够通过调控高迁移组蛋白AT-hook2(HMGA2)和轴蛋白2(Axin 2)增强骨的生成[14]。有报道表明骨转录因子(Runx2)被miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-199b、mir221和miR-133b-3p所调控，而 miR-30 d-5p和 miR-885-5p则负向调控成骨细胞的分化[25]。有研究证实破骨细胞来源的Exosomes miR-214-3p能够抑制成骨细胞的骨形成。因此，抑制破骨细胞内miR-214-3p已经被当作是治疗低骨量引起骨骼疾病的潜在的治疗途径[26]。

6 Exosomes在骨骼肌细胞分化再生、先天性肌病方面的角色

骨骼肌的代谢需要各种因子的平衡，包括分泌蛋白、炎性因子、miRNAs和脂膜类。肌母细胞能够分泌Exosomes，增强肌肉的代谢。体外的几项研究证实在C2C12细胞和人肌母细胞分化过程中，Exosomes的分泌增多[27]。肌母细胞分泌的Exosomes包含有各种生长因子，包括基础成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰岛素样生长激素-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-B1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，具有调控生长、功能、修复的潜能[28]。用荧光标记法检测Exosomes在肌母细胞胞质内的定位，发现肌母细胞不仅能够分泌Exosomes，而且能够内吞这些颗粒。肌小管分泌的Exosomes能够通过cyclin-D1蛋白和myogenin蛋白促进肌母细胞的分化[24]。这些研究证实，肌细胞能够分泌Exosomes，并且能被周围或远处的肌母细胞所内吞，影响其增殖和分化的能力。Exosomes同样具有肌肉修复的作用。用肌肉来源的Exosomes处理受损的肌肉能够降低肌肉的纤维化，增强再生肌纤维的数量[27]，且肌肉的损伤和钙的内流能够刺激Exosomes的释放增多。进一步研究发现，Exosomes在肌肉的损伤修复过程中扮演信号交流分子的角色，其内包含的MiR-206能够通过下调Twist-1蛋白促进肌母细胞的分化[29]。将肌母细胞与含有这些miRNA的Exosomes共同孵育，与直接与miRNA孵育产生的作用类似，能够促进细胞的存活，降低细胞的死亡[30]。Exosomes在强直性肌营养不良症(myotonic dystrophy、DM)也扮演一定角色[31]。DM病情进展的患者中的miR-1、miR-133a/b和 miR-206是升高的，而非进展的患者中该类miRNA没有变化。研究发现这些miRNA能够从Exosomes中分离获得，并且可以随着其他蛋白分子进行流通。因此，有设想管控这些Exosomes的分泌能够间接调节这些miRNA的分布，从而影响病程的进展。

7 总结

以上这些研究都证实Exosomes通过作用于BMSCs、破骨细胞和成骨细胞在调控骨量代谢方面扮演着重要角色，且证实Exosomes在骨组织代谢的治疗中存在很大的潜能。Exosomes的研究已经在肿瘤进展、标志物研究、干细胞产物方面取得了相当显著的进展，而在骨组织方面研究相对较少。目前相关研究显示骨骼相关的Exosomes对于骨组织的维持和修复具有重要作用。提取的骨组织内Exosomes有相当的生物活性，并且能够调控骨组织的维持和修复。另外，关于Exosomes内的miRNA也进行了一些研究，发现miRNA调控许多关键的病理过程，并且提出针对Exosomes内miRNA进行调控能够改善骨代谢。目前研究已经对不同组织来源的Exosomes的功能进行了探讨，但在体内其是如何传播和被捕获，发挥调控的机制是什么，目前研究尚未深入。揭示骨组织中Exosomes发挥功能的作用过程，为治疗骨代谢疾病提供新的策略是目前研究的重点。