食品中金刚烷胺类化合物检测方法的研究

□ 熊 雯 易路遥 吉伟佳 章 红 江西省药品检验检测研究院 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心

金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚胺是母体结构为饱和环癸烷的金刚烷胺类化合物。金刚烷胺、金刚乙胺都是FDA批准的抗甲型流感病毒的药物，能在极低浓度下通过M2蛋白质子通道抑制甲型流感病毒的复制[1-3]。美金刚胺是金刚乙胺的同分异构体，作用机理相似。虽然许多国家禁止在家禽养殖中使用金刚烷胺和金刚乙胺[4-5]，但在中国和美国，这类化合物仍被非法用于家禽（尤其是鸡）养殖中[6]，原因可能是：①金刚烷胺类化合物价格低廉，抗流感病毒活性好；②农户为减少在禽流感肆虐流行期间的经济损失，不顾法律法规定期给禽类喂食药物；③饲料厂家在产品中添加药物，从而吹嘘该产品具有增强机体抵抗力的功效。金刚烷化合物的滥用，使得耐药菌株出现，并呈增加的趋势[7]。

在我国，兽药已从传统线下营销模式慢慢转向互联网营销模式，2019年9月，在“某”宝、“某”多多、“某”巴巴等APP上搜索“金刚烷胺兽用”“金刚乙胺兽用”，发现不少商家销售金刚烷胺类化合物。同时，还有部分商家宣传金刚烷胺类化合物具有预防和治疗畜禽及家禽流感病毒的功效。鉴于金刚烷胺类化合物在我国的滥用情况，本文对近年来金刚烷胺类化合物的检测方法进行综述，希望为监管检验研究人员提供参考和借鉴。

1 色谱分析法

1.1 高效液相色谱技术

高效液相色谱技术（HPLC)是有机化合物分析运用中最普遍的一种检测方法。HPLC法的检测器有紫外检测器（包括UV、DAD)、电化学检测器（ECD）。金刚烷胺类化合物是稳定饱和的三环胺化合物，仅吸收小于200 nm的波长辐射，紫外响应极小，需经衍生化才能通过紫外检测器测定。F.A.L.Van Der Horst等[8]采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）胶束介导，研究了尿中金刚烷胺柱前衍生结合反相高效液相色谱的在线测定方法。在60 ℃和pH为11条件下，金刚烷胺与1-氟-2，4-二硝基苯进行衍生化，4 min内完全转化为含有色基团的衍生物，从而产生紫外检测信号。该法检测金刚烷胺的低限是75 ng/mL。刘益庆等[9]采用蒸发光散色高效液相色谱法测定小儿氨酚烷胺颗粒中盐酸金刚烷胺的含量，蒸发光散色检测器是通用质量型检测器，可以检测任何有机物质，用于基质干扰小化合物的检测，对于食品等复杂基质并不适用。

1.2 气相色谱法

张翠芬等[10]采用甲醇∶三氯乙酸（1∶1）提取饲料中金刚烷胺，经MCX阳离子固相萃取柱净化，建立检测金刚烷胺含量的FID气相色谱外标定量法。饲料中金刚烷胺的添加量一般为100～200 mg/kg，该方法检出限为1.0 mg/kg，其回收率为76.9%～98.3%，相对标准偏差小于5%，以上参数均符合实验要求。

1.3 高效液相串联质谱仪法

高效液相色谱-质谱联用仪对金刚烷胺类化合物的定性和定量检测具有较高的准确度。因此，HPLC-MS法成为这类化合物研究分析最主要的方法[11-12]，也是我国法定标准使用的唯一方法。

Dawei Chen等[6]提出一种提取鸡肌肉中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚胺的分散微固相萃取法（DMSPE）。试验以1%酸性乙腈为提取溶剂，磁性阳离子交换聚合物为吸附剂，采用DMSPE净化技术得到供试品溶液， 经 HSST3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）色谱柱分离，UHPLCHRMS测定金刚烷类药物的含量。结果表明，DMSPE方法简便、有效，适用于鸡肌肉中金刚烷类药物的提取，提取时间相对较短。Yinliang Wu等[13]以d15-金刚烷胺、d4-金刚乙胺-、d6-美金刚胺为内标，采用多壁碳纳米管（MWCNTs）作为反相分散固相萃取（r-dSPE）材料，结合超高液相色谱串联质谱仪，建立同时测定鸡肌肉中金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚胺含量的方法。在最佳优化条件下，鸡肌肉中3种药物的回收率为96.8%～104.6%，变异系数（CV）为3.8%～6.4%。

1.4 气相色谱串联质谱法

N Narasimhachari等[14]采 用 两步法从生物样品中提取金刚烷胺，经二硫化碳处理，转化为其异硫氰酸酯（NCS）衍生物，以苯丙胺为内标物，再以NCS-金刚烷胺进行定量。

2 酶免疫法

2.1 酶联免疫吸附法（ELISA）

酶联免疫吸附法是一种由吸附底物、免疫识别和酶标组成的免疫检测方法。其优点是前处理快捷方便、仪器便宜易操作；缺点是灵敏度和准确度较低。该法在食品农药残留、真菌毒素、兽药残留中广泛运用，近年来在食品安全性快检技术中成为发展热点。

Dapeng Peng等[15]致力于研发一种对金刚烷胺类化合物具有高亲和力的单克隆抗体（mAb)，该抗体对AMA（半抑制浓度为100%）和RIM（半抑制浓度为70.6%）具有交叉反应活性，并通过ELISA法检测可食用鸡组织中金刚烷胺和金刚乙胺，金刚烷胺和金刚乙胺的检出限均达5.1、5.5 μg/kg。实验喂养20批阳性鸡样品，同时采用酶联免疫吸附法（ELISA）和高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）检测，发现ic-ELISA与HPLC-MS的结果具有良好相关性。

谭庶等[16]合成出可特异性识别金刚烷胺的单克隆抗体，采用间接竞争酶联免疫吸附分析法测定鸡肉基质中金刚烷胺的含量。实验发现，金刚烷胺与结构和功能类似物的交叉反应率均小于0.01%，但与金刚乙胺交叉反应率为29.89%，其在0.07～6.15 μg/L线性良好，检出限为0.21 μg/L，鸡肉样品中添加回收率为101.69%～108.71%，变异系数低于10.57%。

2.2 化学发光免疫分析法（CLEIA）

化学发光免疫分析法（CLEIA）是将化学发光法（CL）与酶联免疫吸附法（ELISA）技术相结合，具有化学发光反应的高灵敏度与免疫反应的高特异性两种优点[17]。近年来，CLEIA被广泛应用于多种食品痕量分析领域[18-19]。

崔廷婷等[20]以AMD单克隆抗体与磁珠偶联形成AMD磁标抗体，鲁米诺+对羟基联苯+过氧化氢作为发光物质，建立动物组织、兽药、饲料中金刚烷胺残留化学发光酶免疫分析方法。该方法的半抑制浓度为0.481 μg/L，在3种基质样本中的检测限为0.1 μg/kg，添加回收率在80.2%～94.5%。金刚烷胺的印迹因子达到2.33，金刚乙胺、美金刚胺、曲金刚胺3个结构类似物的选择性因子达到6.20、5.29和3.95。

3 分子印迹电化学传感器技术

分子印迹技术是基于免疫原理发展形成的一种新兴分子识别技术。传感器的分子印迹聚合物与基质样品中的目标化合物会发生识别作用，从而产生一些物理学信号（电极、电阻等）变化，通过效应器转换成可测信号，以检测目标化合物；合成的分子印迹聚合物代替生物受体作为传感器的识别元件逐渐成为许多研究的重点[21]。

Yaguang Yun等[22]以金刚烷胺作为模板分子，邻氨基苯硫酚为功能单体，通过电沉积技术在金电极表面聚合形成聚邻氨基苯硫酚聚合物膜，研制了一种用于动物源性食品中金刚烷胺残留检测的新型分子印迹聚合物电化学传感器。为使分子印迹传感器的性能达到最佳，优化了模板/单体比、CV扫描循环数、浸渍时间等系列参数。实验表明，金刚烷胺的印迹因子达到2.33，金刚乙胺、美金刚胺、曲金刚胺3个结构类似物的选择性因子分别达到6.20、5.29和3.95。该方法与典型的高效液相色谱-串联质谱联用方法所得结果一致，具有较高的相关系数（R2＞0.99）。

4 荧光探针技术

荧光探针技术是针对不具备荧光或者弱荧光特性的化合物，用间接法来进行荧光检测的一种技术。金刚烷胺、金刚乙胺是三环癸烷化合物，没有天然荧光，常规荧光法无法直接测定，大量文献报道荧光光谱利用荧光探针技术测定其含量[23-25]。

4.1 超分子包合物探针

具有一定尺寸空腔的超分子环糊精、杯芳烃、葫芦脲等主体分子和客体分子（荧光指示剂）以分子间弱相互作用（静电相互作用、氢键、范德华力等）在溶剂体系形成稳定的化合物，待测化合物通过与荧光指示剂竞争空腔，引起荧光强度的改变来进行含量测定[26]。Guangquan Wang等[,25]以黄连碱-葫芦[7]脲为荧光探针体系测定药品制剂和尿液中金刚烷胺和金刚乙胺含量，线性范围在0.004 0～1.0 μg/mL，通过荧光光谱法、核磁共振氢谱和分子模型计算，研究了两种药物与黄连碱竞争葫芦[7]脲空腔的超分子相互作用机制。朱林照等[,26]合成了一种荧光指示剂ABAM，它和葫芦[7]脲构建成新的荧光探针体系，对金刚烷胺有较好的特异性、同时抗干扰性强，其结合常数为8.7×10-8M-1，金刚烷胺化合物在0.000 188～0.375 μg/mL范围内线性关系良好，最低检测浓度为6.5×10μ5μg/mL。该荧光探针系统对药物及动物肉类等样品中金刚烷胺浓度的检测具有重要意义。本研究利用内过滤效应（IFE）将CDs引入酶联免疫吸附试验（ELISA）系统，研制了一种新型荧光酶联免疫吸附试验方法。

4.2 碳点探针

碳点是指三维空间尺寸均在1～10 nm的零维度碳纳米晶体[27]。近两年，碳点因其光致发光特性，较高的荧光稳定性，良好的生物相容性，在食品安全检测领域展现广泛的应用前景[28]。

Baolei Dong等[29]以碳点（CDs）和MnO2纳米片（NSs）的纳米组装物为荧光探针，建立一种荧光酶联免疫吸附法用于检测食品中金刚烷胺，碳点（CDs）作为荧光底物，MnO2纳米片为荧光淬灭剂及识别单元，形成p-CDs@MnO2NSs的探针体系。2-磷酸抗坏血酸经抗体标记的碱性磷酸酶（ALP）催化，水解生成抗坏血酸，其能分解纳米组装物，使CDs游离从而恢复荧光。荧光强度的变化与溶液中金刚烷胺的浓度有关，该法线性范围为0.048～1.1 ng/mL，检测限（LOD）为0.035 ng/mL。

5 结语

高效液相色谱串联质谱法是测定食品中金刚烷胺类化合物最经典的分析方法，具有高选择性、高灵敏度、高准确度和无需衍生等优点，且常被用于评估其他检验方法的优劣。近年来，各种仿生抗体、超分子和纳米晶体成功制备，并运用于金刚烷胺类化合物含量测定，这类方法属于分子识别技术，但文献鲜有报道相似结构化合物是否存在干扰，这一系列方法操作较为简便，为金刚烷胺化合物的检测提供了良好的思路，将来也必是检测技术发展的新方向。