家蚕抗BmNPV品种选育研究进展

何艳茹 夏冬梅 袁桂阳 曹宁宁 肖 慧 陈永波

(四川省南充蚕种场，四川南充 637000)

家蚕(BombyxmoriL)起源于中国，由栖息于桑树的原始野蚕驯化而来，已有五千多年的历史，是迄今为止唯一被人类完全驯化的经济昆虫。家蚕以桑叶为食，其茧可缫丝，蛹可食用，具有重要的经济价值。作为茧丝绸生产和出口大国，我国的家蚕茧产量占世界总产量的三分之二左右[1]。纵观历史发展，家蚕在提高人类物质文明水平、传播中国传统文化以及加强东西方文化交流等方面都做出了重要贡献。

家蚕作为国际公认的鳞翅目模式昆虫，在生命科学研究领域也发挥着重要作用。在家蚕病理研究中，按病原微生物种类不同，将传染性蚕病分为病毒病、细菌病、真菌病和原虫病4类。由病毒引起的传染性蚕病主要有3种：即血液型脓病、中肠型脓病和病毒性软化病。这3种病毒病是养蚕生产中危害最大的蚕病，约占总发病比例的80%，其中由家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus，BmNPV)所引起的家蚕血液型脓病危害最为严重[2]。培育对BmNPV侵染具有较高抗性的家蚕品种，是控制该病对蚕业生产危害最经济有效、安全环保的手段。多年来，蚕业科研人员一直致力于筛选抗BmNPV家蚕种质资源、发现抗性基因、阐明抗性分子机制，以期通过传统常规育种或现代分子育种手段选育出对BmNPV具有较高抗性的家蚕新品种，减小蚕病危害，提高经济效益。目前，相关研究已取得了一定进展，育成并在生产中推广应用了家蚕抗BmNPV品种华康2号[3]、华康3号[4]、野三元(抗)[5]、桂蚕N2[6]等，现将家蚕抗BmNPV品种选育研究进展综述如下，供同仁参考。

1 家蚕核型多角体病毒

1.1 杆状病毒简介

BmNPV属于杆状病毒，广泛存在于节肢动物中。据有关报道显示，杆状病毒能感染包括鳞翅目、双翅目、直翅目、膜翅目等在内的7个目的超过600种昆虫[7]。据第五届国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses，ICTV)报告，杆状病毒分包涵体杆状病毒亚科和非包涵体杆状病毒亚科2个亚科[8]。据第八届ICTV报告，杆状病毒分核型多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV)2个属[9]。最新的分类方法将杆状病毒分为α杆状病毒属(鳞翅目核型多角体病毒)、β杆状病毒属(鳞翅目颗粒体病毒)、γ杆状病毒属(膜翅目核型多角体病毒)、δ杆状病毒属(双翅目核型多角体病毒)4个属，BmNPV属于α杆状病毒属[10]。依据囊膜内的核衣壳的数量可以将NPV分为单粒包埋型NPV(SNPVs)和多粒包埋型NPV(MNPVs)2类，BmNPV属于单粒包埋型NPV[7,11]。

1.2 杆状病毒作用机制

由BmNPV引发的家蚕血液型脓病是家蚕饲养过程中常见的危害最严重的一种病毒病[12]。BmNPV由含有双链环状DNA(dsDNA)的核衣壳和外被囊膜组成[13]。BmNPV主要有2种存在形态：一是病毒感染初期核衣壳以出芽的方式形成芽生型病毒粒子(budded virus，BV)[14-15]，在宿主细胞中复制装配后，释放到细胞外感染邻近的细胞；二是在感染宿主的后期生成包埋型病毒粒子(occlusion derived virus，ODV)[14，16]，这些ODV被多角体蛋白包埋形成包涵体(occlusion body，OB)[17]，最终造成家蚕细胞破裂、血淋巴浑浊，引起家蚕发病死亡。

1.3 杆状病毒感染家蚕后病毒粒子的侵染途径

家蚕感染BmNPV的主要途径是经口食下感染，BmNPV包涵体进入中肠后在碱性环境下释放病毒粒子[14]。虽然大部分病毒粒子会被家蚕本身的防御反应清除，但是仍有一部分会穿过围食膜(peritrophic membrane，PM)附着在中肠的微绒毛上[18]，进而释放核衣壳进入中肠细胞并通过核孔进入细胞核，在细胞核中复制组装新的核衣壳。在病毒感染初期核衣壳以出芽的方式形成的BV[14-15]释放到细胞外感染邻近的细胞，或者释放到血淋巴中并随着血淋巴的循环感染其他组织。病毒感染的后期生成ODV[14，16]，这些ODV在细胞核中聚集形成包涵体[19]，最终导致家蚕细胞破裂、血液浑浊，引起家蚕发病死亡。

2 家蚕抗BmNPV病国内外研究进展

目前，已有许多关于家蚕与BmNPV感染、抗性的研究，主要研究方向为家蚕基因组学和家蚕蛋白质组学，也有学者将转基因技术应用到家蚕抗BmNPV品种的培育中。

2.1 家蚕对BmNPV抵抗性的遗传研究

易文仲研究表明家蚕杂交F1、F2代经口感染BmNPV后，抵抗性受父本影响较大，有偏父遗传现象[20]。荒武义信[21]实验结果显示，杂交F1代对BmNPV的抵抗性受母本影响较大，后代未见受亲本的影响。鲇沢千寻[22]发现雄体的抵抗性要大于雌体。孟启智[23]运用对数浓度-极值模式曲线分析法研究后认为，家蚕对BmNPV经口感染后的抵抗性主要受1对位于常染色体上的显性基因和若干微效基因控制，有偏父遗传现象，F1杂合体的抗病性有超显性现象；品种间的抗病性差异明显，强弱开差达800余倍。陈克平等[24]认为家蚕对BmNPV的抵抗性是受2对以上基因控制的，有偏父遗传现象。家蚕对BmNPV感染抵抗性有以下几个特点：一是具有杂种优势，F1代有明显的超显性现象，继代越往后杂种优势逐渐减弱；二是有偏父遗传现象，且雄体抵抗性大于雌体[24]。因此认为，家蚕对该病的抗性可能主要由1对常染色体上显性主效基因和位于Z染色体上若干微效基因控制。

2.2 抗BmNPV家蚕品种的调查

鲇沢千寻[22]和荒武义信[21]分别采用蚕体皮下感染和经口感染BmNPV的方式对家蚕进行了BmNPV抵抗性的调查，认为家蚕不同品种对BmNPV抵抗性有很大差异。我国学者吕鸿声[25]首先研究了家蚕品种对BmNPV的抗性差异。张远能等[26]对33个品种进行了抗BmNPV鉴定，发现了抗性品种与易感品种的抗病能力相差近千倍。陈克平等[27]对中国农业科学院蚕业研究所保存的344个品种(品系)进行了抗BmNPV鉴定，发现从化性角度看品种对BmNPV抗性强弱顺序为多化>二化>一化，日一化>欧一化>中一化，日二化>中二化。

2.3 抗BmNPV品种选育常规技术

家蚕抗病品种作为育种的主要目标之一，是提高家蚕对病原体抵抗能力的主要途径。进行育种前，必须对家蚕种质资源的抗病性及经济性状进行调查，掌握具有一定抗病能力或经济性状突出的家蚕种质资源。兼备较强抗病能力和优良经济性状的家蚕种质资源很少，因此选育时一般会选择饲养表现良好的种质资源作为基础材料，然后通过感染高浓度的BmNPV，存活个体继代，同时进行经济性状选择，经过多次添毒继代后，提高其抗病能力。在传统抗BmNPV育种工作中，因其存在偏父遗传现象，一般将具备高度抗BmNPV病的品种作为父本，与经济性状优良的品种进行杂交，F1代与经济性状优良的轮回母本回交，后代饲养时人为感染BmNPV，以不发病个体继代，经多代选育后，育成具备优良经济性状和较强抗病能力的家蚕品种。

吴福泉等[28]利用两广蚕区生产上推广应用的强健抗性品种，优选8个母种进行6代添食BmNPV选拔试验，每个品种选取2～3个蛾区，其中一半添毒，另一半正常饲养，8个母种对BmNPV抗病能力均有不同程度的提高，且经济性状稳定，其中春5品种的发病率由63%下降到23%，虫蛹统一生命率从36%提高到76%，累代添食BmNPV选拔效果显著。

徐安英等[29]选用对BmNPV具有高度耐受性的品种N作为母本，以我国蚕区推广较多的实用家蚕品种秋丰、白玉为父本分别进行杂交，F1代与轮回父本秋丰和白玉回交4代(每代添食BmNPV)，然后进行多代自交，纯合固定耐受基因并选择经济性状，最终育成高抗BmNPV的家蚕新品种秋丰N×白玉N(华康2号)，其对BmNPV多角体的LC50值达到2.033×109个/mL，是秋丰×白玉对BmNPV多角体LC50值的12 115 倍，是菁松×皓月对BmNPV多角体LC50值的10 304倍，抗BmNPV效果非常显著。

2.4 最新抗BmNPV病品种选育技术

2.4.1 家蚕抗病分子标记辅助育种研究 分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)是随着分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择。由于分子标记辅助选择方法相对简单，可以进行早期筛选，因此提高了选择强度并缩短了世代间隔，从而提高了育种的效率和准确性。

目前，已有多项分子标记技术应用于家蚕基因的研究，并构建了几种家蚕分子标记遗传图谱。不断发展和完善的分子标记技术，已经在家蚕新品种的选育过程中得到广泛应用，在家蚕抗性品种辅助选育方面也发挥了重要的作用。

刘晓勇等[30]对含有抗BmNPV病主效基因的家蚕品种NB和高敏感品种306及其近等基因系统BC9等，采用500个RAPD随机引物分别在各个品系的DNA混合物中进行扩增以筛选分子标记，获得与家蚕抗BmNPV病有关的3个分子标记：OPF-072 023、OPJ-131 300、OPM-161 200。

姚勤等[31-32]利用我国家蚕种质资源中发现的高抗BmNPV材料NB和敏感材料306，构建了3种家蚕抗BmNPV病近等基因系，采用RAPD技术获得分子标记，将标记转换成特定序列扩增(sequence characterized amplified region，SCAR)标记，利用SCAR标记辅助家蚕抗BmNPV新品种育种选择，获得了家蚕抗BmNPV新品种抗NPV-1。

曹锦如等[33]通过添毒等常规方法明确育种材料的抗性性状，对育种材料进行了BmNPV抗性基因连锁分子标记，进一步明确标记基因与抗性性状间的遗传相关性，并据此筛选出BmNPV抗性品种“多化N”和敏感性的实用品种“春华”作为育种素材，并从该特定品种“多化N”中获得了特异性连锁片段(EU564814)。

2.4.2 抗BmNPV转基因家蚕基因水平的研究 把抗病基因导入家蚕体内培育出抗病品种是转基因家蚕研究中的重要内容之一。家蚕转基因育种一般是利用病毒致病基因反义核酸来抑制病毒复制基因，或将基因治疗核酸或核酶高效结合，对外源致病基因既能阻止其表达，又有切割作用，从而提高家蚕的抵抗力。或者通过转基因技术把相关的抗病基因导入家蚕体内。

张峰等[34]将含核酶基因的线性化重组质粒pGL2Rz用基因枪导入家蚕早期受精卵中(G0代)，孵化率约为80%。检测G1代5龄家蚕血淋巴的荧光素酶活性，获得14条荧光素酶表达转基因蚕；并且从G2代开始通过BmNPV攻击来筛选抗性较高的家蚕进行传代，在G4代获得1区对BmNPV抗性强度比对照组高10.00倍的转基因家蚕。对该区5龄蚕基因组DNA进行PCR检测和Southern杂交结果证明，核酶基因多拷贝地整合在家蚕染色体上，利用RT-PCR能检测到蛹期核酶的表达。研究结果表明通过转基因技术可以获得抗BmNPV的核酶转基因蚕。

家蚕对病害的抵抗性一般受多基因控制，且绝大部分抗性相关基因在染色体上的位置尚未明确，因此直接进行转基因抗病育种比较困难。近年发展起来的RNA干涉(RNAi)技术有望解决这一难题。ISOBE等[35]2004年第1次报道了利用RNAi技术增强了转基因细胞及家蚕对BmNPV的抗性。利用piggyBac转座子介导获得表达BmNPV重要的晚期表达因子lef-1的长片段dsRNA的转基因家蚕，在接种BmNPV病毒后72 h，转基因家蚕血淋巴中的病毒DNA水平与对照组相比降低了10%。但是并没有降低感染BmNPV家蚕的死亡率。

叶秋霞等[36]将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入蚕卵，经遗传霉素(G418)和绿色荧光蛋白(GFP)双重筛选并结合分子生物学鉴定，证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄起蚕接种BmNPV，结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕下降了10～30个百分点，转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高：对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示，2个系统的lef-1 mRNA转录水平分别比对照组平均降低了72.00倍和26.50倍，最高下降了104.00倍，进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPVlef-1基因的表达。

2.4.3 抗BmNPV家蚕基因编辑水平的研究 基因编辑是指利用分子生物学的方法，按照人们预定的目的对生物基因组的特定位点进行特异性的删除、替换、插入等人工突变，从而获得特定的基因组序列，进而获得期望的生物遗传特异性[37]。目前的基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)，类转录激活效应物因子核酸酶(TALENs)和成簇的、有规律的间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)[38]。而CRISPR/Cas9是目前编辑效率最高、载体构建最简单、成本最低的一种方法。

DONG等[39]2016年首次在家蚕细胞中建立了高效病毒诱导型的CRISPR/Cas9系统，用BmNPV诱导型启动子39 k启动Cas9蛋白的表达，靶向编辑病毒的极早期基因ie-1，结果表明靶向编辑BmNPV基因组后，明显地抑制了BmNPV的增殖复制，而且由于使用病毒的39 k启动子启动Cas9蛋白的表达，也在很大程度上降低了脱靶效率。CHEN等[40]2017年通过转基因技术和基因编辑技术的结合，构建了靶向敲除BmNPV的me53和ie-1基因的转基因家蚕，同时进行抗BmNPV检测，其对BmNPV的抗性有了明显的提高。DONG等[41]2018年通过构建单独的CRISPR/Cas9转基因家蚕和sg RNA转基因家蚕，定向地编辑ie-1基因之后，使转基因家蚕对BmNPV的抗性有了显著的提高，同时对靶位点的编辑效率有了明显的提高。董非凡[42]利用CRISPR/Cas9系统，从BmNPV增殖相关基因和抗凋亡基因入手，构建一个同时敲除BmNPV抗凋亡基因iap2基因和增殖复制相关基因orf59的转基因家蚕，对BmNPV多角体的半数致死剂量(LD50)较对照(非iap2和orf59的转基因家蚕)提高了100.00倍，为培育转基因抗性素材提供了一个新的思路。

2.4.4 抗BmNPV转基因家蚕蛋白质组水平的研究 目前，家蚕抗BmNPV的研究主要是在致病机理、传染途径、DNA分子标记和转录水平等方面，家蚕蛋白质组水平研究还在刚起步阶段。

蔡克亚等[43]利用遗传学原理，通过杂交和回交的方法建立了家蚕抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因品系模型，利用2-D电泳和MALDI TOF/TOF MS质谱技术，从蛋白质组水平上研究家蚕对BmNPV的抗性。获得家蚕BmNPV抗性品系NB、感性品系306、近等基因品系BC8的5龄起蚕血淋巴液蛋白差异表达谱，分别获得180、190、187个蛋白点，其中80%的蛋白点集中在等电点5～9范围之内。从3块凝胶上共获得明显差异蛋白点12个，经质谱鉴定为β-1，3-葡萄糖识别蛋白、酚氧化酶、氨基酰化酶(aminoacylase)、羟脯氨酸异构酶、溶酶体硫醇还原酶IP30前体Ⅰ型5种蛋白，其中氨基酰化酶仅出现在抗性品系NB、近等基因品系BC8图谱中，在感性品系306图谱中没有出现，初步推测是与家蚕抗BmNPV相关的1个重要蛋白，为首次报道。

日本学者PONNUVEL等[44]于2003年从家蚕肠液内分离获得家蚕脂肪酶1(Bmlipase-1)，通过实验证明其具有很强的抗BmNPV的ODV活性。陈杰[45]通过基于piggyBac转座子的转基因技术构建了增量表达病毒抗性蛋白Bmlipase-1的转基因载体，经显微注射成功获得病毒基因ie1启动子启动的Bmlipase-1表达的ie1+lipase-1转基因品系和肌动蛋白A4为启动子启动的Bmlipase-1表达的A4+lipase-1转基因品系，经基因表达量分析表明，转基因系统的病毒抗性蛋白家蚕保存种对BmNPV的抗性蛋白表达量明显高于非转基因系统。对转基因系统进行病毒攻击测试，结果显示相较于非转基因系统，转基因系统对BmNPV的抗性均呈现不同程度的提高。即通过转基因过量表达Bmlipase-1，获得的转基因品系对BmNPV的抵抗能力有一定提高。不同家蚕品种对BmNPV的抗性存在非常大的差异[27]，相关研究显示Bmlipase-1的表达量与家蚕品种对BmNPV的抗性水平有着一定的关联，即对BmNPV抗性越强的品种其Bmlipase-1的表达量越高[46]。研究结果表明，内源增量表达病毒抗性蛋白也是增强宿主抗性的一种手段，为抗病品种选育提供了一定的参考。

3 展望

鉴于BmNPV病对蚕桑生产危害的严重性，人们对该病害的病原类型、侵染途径、预防方法、家蚕抗性遗传规律等诸多方面进行了大量研究。目前，蚕桑生产上使用的抗BmNPV病品种主要是由传统方法育成的。分子标记、转基因、基因编辑、内源增量表达病毒抗性蛋白等技术在家蚕抗BmNPV病育种中发挥重要作用，不仅可以缩短育种周期、提高准确性，在丰富家蚕种质资源、减少病害发生、提高蚕业经济效益等方面亦具有深远的意义。

随着对抗BmNPV病基因、病毒抗性蛋白的深入研究，相关技术研究进一步完善，结合各项研究结果，将进一步探明家蚕抵御BmNPV侵染最简单有效的途径。因此，利用抗BmNPV病基因、病毒抗性蛋白与传统育种方法相结合开展抗病育种，将是未来一种更快捷更高效的家蚕育种途径。