纳米标记免疫层析技术在食品快速检测中的应用进展

□ 李慧琴 易云婷 彭 程 广州市食品检验所

1 引言

食品快速检测主要针对食用农产品、散装食品、餐饮食品及现场制售食品中禁限用的农兽药、非法添加物质、生物毒素、污染物及食源性致病微生物进行快速检测，是监管部门在日常监管、专项整治、活动保障等现场检查工作中的重要手段，可提升执法的公信力，并对食源性疾病起到预防作用。

免疫层析技术是食品快速检测的一种主要形式，是20世纪90年代初发展起来的一种新型快速免疫分析技术[1]，其核心原理是以纤维层析材料为载体，借助毛细管的作用推动检测样品在载体上层析移动，使样品中的目标分析物与载体上的抗体结合，并通过肉眼检测或仪器读取所偶联的标记物来判定检测结果。目前，该项技术已广泛应用于水产品、畜禽肉中兽药残留、违禁药物快速检测及水果蔬菜等农产品的农药残留快速检测，食品添加剂及非法添加物的快速检测；粮食、食用油、乳品中真菌毒素的快速检测，各类食品中污染物及病原性致病性微生物的快速检测等领域。

免疫层析技术从原理上根据分析目的及分析物大小的不同等可分为两种类型：双抗体夹心和竞争法[2]。双抗体夹心法常用于检测具有多个抗原表位的大分子抗原，如大分子蛋白质、食源致病菌、病毒等；竞争法用于检测只具有单个抗原表位的小分子抗原，如农兽药残留、非法添加物等。目前，随着纳米技术的发展，纳米材料在免疫层析分析技术中的应用十分普遍，常用于标记抗体抗原，根据纳米颗粒的不同，可将免疫层析技术分为：胶体金免疫层析技术、荧光标记免疫层析技术（荧光微球免疫层析法、量子点荧光免疫层析技术、时间分辨荧光免疫分析、上转发光免疫层析技术等）和磁珠免疫层析技术。本文主要针对以上标记免疫层析技术的研究热点及最新的研究方向和成果进行论述。

2 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术就是以胶体金为标记物对目标物进行定性或半定量测定的免疫层析方法。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠及鞣酸等的作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由在静电作用下成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的静电结合体，并且不影响蛋白质的生物特性。胶体金免疫层析试纸条以其简便、快速、便携及、结果易判读等特点，在食品安全快速检测领域发挥着重要作用，已经商品化的胶体金免疫层析试纸条包括：检测瘦肉精、氯霉素、孔雀石绿、硝基呋喃类、磺胺类及喹诺酮类等兽药残留的胶体金快速检测试纸条；检测部分菊酯类、有机氯类、杀菌剂类、有机磷类及氨基甲酸酯类农药残留的胶体金快速检测试纸条；检测黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、呕吐毒素等真菌毒素的胶体金快速检测试纸条；检测罗丹明B、罂粟壳等非法添加物的胶体金快速检测试纸条；检测沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7等食源性致病微生物的胶体金快速检测试纸条。但是胶体金免疫层析试纸条仍存在不可忽视的缺点，例如应用在一些限量要求较苛刻的检测项目中时，其灵敏度达不到要求，且只能实现定性或半定量,多为单一组分测定等。目前有研究在原有技术的基础上通过采用添加增敏剂或引入生物素-亲和素系统以提高检测信号的灵敏度[3,4]，另外，可采用多膜复合受体或单膜多元受体固定的方式实现多元测定[5]。

3 荧光标记免疫层析技术

荧光标记免疫层析技术，是荧光免疫标记技术与传统免疫层析技术相结合的一种新型定量检测技术。该技术既保留了胶体金免疫层析技术简便、快速、便携的优点，又通过荧光示踪增强技术实现了定量检测。荧光免疫标记可以用荧光素直接标记，也可以用荧光微球标记。传统的荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC)、四乙烯基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等具有光学性质不稳定,容易发生光漂白，荧光量子产率较低，吸收波长较短等缺点，限制了它们的广泛应用，而量子点、时间分辨微球、上转发光材料等新型荧光标记物在食品安全快速检测中具有更好的应用前景。

3.1 量子点荧光微球免疫层析技术

量子点（Quantum dots，QDs）是一种半导体纳米晶体，是由II-Ⅵ族元素（如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe及ZnS等）或Ⅲ-Ⅴ族元素（无镉量子点，如InP、InAs等）等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构（如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等）。QDs能够接受接收激发光，产生荧光，其中研究较多的主要是CdX（x=S、Se、Te）[6]。作为一种新型荧光标记材料，基于表面活泼基团的修饰，可与生物大分子进行偶联，与传统荧光染料相比，QDs具有一元激发多元发射、激发光谱宽、发射光谱窄而对称、光稳定性好和抗漂白能力强等特点。而将大量QDs包裹于聚合物材料制备得到的量子点微球则可表现出更高的荧光强度和更好的光学稳定性。与传统免疫层析技术多个指标需要对应多个T线不同的是，基于QDs的多重检测可在仅设置一条T线和一条C线的前提下实现。

丁乔棋等[7]以羧基化CdTe/ZnSe量子点荧光微球为标记物，通过EDC/NHS法将氯霉素（CAP）单克隆抗体与量子点荧光微球偶联制备荧光探针。氯霉素全抗原（CAP-HS-BSA）及羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维素膜，形成检测线（T线）和质控线（C线），组装成新型氯霉素量子点荧光微球免疫层析试纸条，建立了可在15 min快速、定量检测牛奶中氯霉素CAP的方法。周耀锋等[8]采用EDC法将抗赭曲霉毒素A（OTA）腹水与量子点荧光微球偶联，制备荧光探针，以牛血清白蛋白-OTA偶联物及驴抗鼠二抗喷涂硝酸纤维膜形成试纸条T线C线，建立了基于T/C荧光强度比值法的高灵敏度、快速定量检测玉米中OTA的免疫层析新方法。

3.2 时间分辨荧光免疫层析技术

时间分辨荧光微球（Timeresolved fluorescent nanobeads，TRFN）是基于镧系元素的新型标记材料，其在延迟时间的帮助下可区分特异性荧光信号和非特异性背景荧光信号[9]。目前使用的镧系元素离子有Eu3+、Tb3+、Sm3+和 Dy3+，它们作为标记材料的原理是荧光反应，其纳米颗粒与胶体金的尺寸相当接近，并且消除了背景荧光，因而被选为免疫层析的新型标记材料。与常规的荧光标记和量子点相比，它们的荧光特性具有独特的应用优势，例如荧光寿命长、发射光谱窄、斯托克斯位移大及光稳定性突出等。

张东升等[10]以Eu3+螯合物的纳米微球为荧光探针标记抗呕吐毒素（DON）单抗，采用竞争抑制建立DON时间分辨荧光免疫层析定量方法，与免疫亲和净化--高效液相色谱法同时测定DON含量，结果无明显差异。樊晓博等[11]通过双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合稀土元素Eu3+，标记抗AFB1的单克隆抗体，以AFB1-OVA为固相抗原，优化反应条件，建立直接竞争时间分辨免疫层析检测黄曲霉毒素B1的高灵敏度、特异性强的方法。赖科阳等[12]通过对时间分辨荧光微球偶联克伦特罗抗体量、CLE-BSA抗原用量、微孔内CLE抗体-TF R N探针体积的优化，建立了定量检测克伦特罗的时间分辨荧光微球免疫层析法。

3.3 上转发光免疫层析技术

上转换发光材料（Up-Converting Phosphor，UCP）是一种有稀土元素掺杂的荧光纳米材料，能够将低能量的近红外光转化为高能量的可见光[13]。与传统的下转换发光相比，具有宽的反斯托克斯位移，无本底干扰，可显著提髙检测的信噪比，不易光解和光漂白，颗粒本身无毒性，应用于免疫层析可同时具有定量、灵敏、无干扰的优点。

王瑜等[14]合成上转换纳米颗粒（UCNPs）-NaYF4：Yb，Er，表面功能化修饰后与己烯雌酚（DES）单克隆抗体偶联，形成荧光探针，以牛血清白蛋白-己烯雌酚（BSA-DES）偶联物和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜，形成试纸条T线、C线，建立了上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测DES的方法，与高效液相色谱法有较好的一致性。姜会聪等[15]以上转换发光材料（UCP）为新型标记物，采用戊二醛法偶联单克隆抗体（mAb），制备UCP-mAb复合物，并以其作为探针，基于小分子竞争结合，成功构建了上转换免疫层析法用于检测雌二醇。李春凤等[16]以上转发光纳米颗粒（UCP-NPs）作为示踪物，基于双抗体夹心检测模型，研制针对甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌O157∶H7、副溶血弧菌4种靶标菌的上转发光免疫层析试纸，简便快速，具有良好的敏感性、特异性和线性定量能力，可满足食品安全检测的要求。

4 磁珠免疫层析技术

超顺磁性纳米颗粒（Superparama gnetic nanoparticles，SPIONs）是一种纳米级的磁性颗粒，其内部含有磁性金属氧化物（如铁、钴、镍及其化合物）的超细粉末，而表面由有机高分子材料结合起来，形成了具有一定磁性及特殊结构的微球[17]。，在其表面还能修饰多种具有生物活性的功能基团（氨基、羧基、醛基等），可以选择性的与抗原、抗体、生物素、和亲和素等通过选择适合的交联剂和交联方式进行结合。在食品检测中的应用比较多的是磁性微球的分离、富集、浓缩的功能，尤其是在致病菌检测方面。而磁性微球的具有强磁性及单分散性等特点，应用在免疫层析系统中可以极大地提高监测分析的灵敏度、稳定性和可重复性。以超顺磁性微球作为信号标记物，可以通过肉眼快速定性分析，也可利用磁信号通过磁性免疫层析分析系统进行定量化检测[18]。

黄艳梅等[19]以喷涂了检测抗原黄曲霉毒素M1-BSA和驴抗鼠二抗形成检测线和质控线的硝酸纤维膜制备免疫层析试纸条，采用EDC/NHS法制备偶联了抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的免疫磁珠。免疫磁珠与待检样本混合，经捕获、磁分离后，浓缩重悬液直接用免疫层析试纸条检测原料乳中的黄曲霉毒素M1。刘道峰等[20]在磁性纳米颗粒上偶联抗猪霍乱沙门氏菌单克隆抗体，通过检测线（T线）喷涂猪霍乱沙门氏菌外膜蛋白，利用待检物与T线抗原的竞争关系，建立了针对大分子靶标的竞争型免疫层析法，用于猪霍乱沙门氏菌的检测；同时基于磁性纳米颗粒，研究建立了新型的两步免疫层析法，高抗体偶联量的免疫磁性纳米颗粒可用于捕获原料乳中的黄曲霉毒素M1（AFM1），热洗脱后采用低偶联量的免疫纳米颗粒指示结果，灵敏度较胶体金标记的免疫层析法提高50倍。

5 免疫层析技术在食品快速检测中的发展方向

目前，随着荧光定量和磁信号定量在食品快速检测中的研究不断深入，纳米标记免疫层析技术将发挥越来越重要的作用，这类技术将朝着高灵敏度、定量分析、多元检测、及层析系统集成化等方向发展。①提高免疫层析技术的灵敏度可以通过选用灵敏度更高的标记物、加入显色增强剂、发展信号放大系统、及浓缩样品等方式来实现。②利用磁珠、荧光素标记物的试纸条进行定性或定量分析时，需要仪器设备对光信号、磁信号进行辨识，例如市面上已有的UPT上转发光免疫分析技术平台、磁信号分析仪、荧光免疫层析读数仪，而微型便携化、智能化、集成化定量检测仪器研究成为免疫层析检测领域的新趋势。③多元化检测是指一次可以检测两种或两种以上的待测物的方法[21]。免疫层析技术实现多元化检测可从以下方面进行深入研究：根据待测物的共同结构设计、制备广谱性抗体；利用单克隆抗体技术或基因工程抗体技术制备双特异性抗体；采用一膜包被多条抗体带的方法以及利用不同的信号探针分别对不同的抗体或抗原进行标记。④由于食品样品基质复杂，其会影响结合垫上指示物质的释放，而硝化纤维膜等试纸条上的组成结构复杂、不均匀以及存在非特异性吸附反应，会使溶液的层析以及检测结果产生差异。研究微流控芯片中的表面修饰和抗体固定技术，将免疫层析方法建立在微流控芯片平台上，制成微流控免疫层析芯片，以提高灵敏度和重复性，也将是未来研究的一个方向。