分子生物学方法在食品微生物检测中的应用

□ 范 鑫 张彦斌 张宏博 内蒙古自治区食品检验检测中心朱叶青 呼和浩特市食品检验所 罗海涛 内蒙古自治区食品检验检测中心

食品安全在各个国家都备受重视，对于食品安全的要求十分严格，食品中绝对不能含有损害和威胁人体的物质和因素。为了保证社会稳定和人体健康，准确检测食品中的一些不安全因素，例如细菌、真菌等，并给予快速及时的解决措施，是当前各个国家都非常重视的话题，构建健康和谐社会，做好食品安全检测是重大战略性问题[1]。传统的微生物检测方法效率低、步骤多，而且对于生长缓慢和新型的微生物的检测难度较大，因此需要研究更加快速准确的检测方法，而分子生物学检测法经过实践证明具有独特的优势。

1 传统的食品微生物检测方法分析

研究表明，传统可培养微生物仅占环境总微生物的1%左右，高达99%不可培养微生物才是微生物的主体。依靠培养手段，在生物多样性上不能反映微生物的真实状况，传统的检测方法以染色法和培养法为主，主要依赖于分离培养和细菌体外培养。传统微生物检测方法在检测时间、可检测的微生物数量以及灵敏度等方面存在诸多不足：①样品培养导致检测时间长，传统生物检测时间几小时甚至几天；②鉴定微生物种类有限，准确度一般；③流程复杂，尤其是样本培养和处理，且污染概率高。

分子生物技术在微生物基因检测领域正快速崛起，以NGS和临床质谱检测为主，并具有速度快、通量高、省去样品培养环节、污染风险较低、准确度较高、检测范围广以及试剂耗材相对较少且成本低的优点[2]。

2 基于分子生物学的微生物检测新技术

相比传统方法，微生物基因检测新技术有明显优势。以基因序列多样性，使用核糖体小亚基RNA将细菌部分序列作为分子标签，以代替对基因组核酸的研究，这种方法主要采用基因探针、荧光定量PCR、基因芯片和荧光原位杂交等方法检测物种的多样性。

2.1 荧光原位杂交

直接与经过处理的细胞进行杂交，在放射性原位杂交的基础上取代同位素标记，形成了一种荧光标剂杂交方法。将带有荧光标记的寡核苷酸探针导入细胞内内，使其与细胞内的核酸结合，用荧光显微镜进行观察，检测带有杂交荧光标记的细胞，通过计算杂交率，定量细菌。对于人工微生物环境检测中的不足可以予以弥补，通过纯化和扩增步骤，实现对微生物个体的分析，其技术优势体现在不同微生物群落之间差异的分析上[3]。

2.2 基因探针检测方法

基因探针技术由美国华盛顿卡内基学院的研究人员创建创建，它是以互补基因为基础，使序列互补核酸在食品检测中发挥作用。近年来基因探针技术广泛应用于食品微生物检测，能够对致病性微生物进行快速灵敏的检测，基因探针技术广泛应用在食品微生物检测中，对于每一种病原体的关键性核酸片段进行制备，通过分离和标记，结合目的核酸序列，使得特定病原体在药品中被发现，并用特定的方法进行测定，以此确定样品中有无特定病原体。核酸探针技术灵敏性高，具有特异性，而且兼具组织化学染色的定位性和可见性。因此国外研究者已经发明了多种基因探针检测技术，例如对食品中的沙门氏菌进行检测的基因片段探针，对单核细胞增生李斯特菌进行检测的自动化酶连接非放射性DNA探针，以及成功鉴定大肠杆菌的独立基因探针等[4]。

2.3 PCR技术

模板在数小时内，在引物的引导下，对特定的DNA序列进行复制，在数小时内进行百万倍扩增，根据序列特异性，得到食品致病性微生物检测结果，利用检验的特异性和灵敏度的优势，快速得出正确的检验结果。常见的方法有普通PCR、巢式PCR、多重PCR以及荧光定量PCR等，经过实践具有指导意义。通过设计保守区引物，使得各种细菌间的种系序列的可变性增大，对信息进行分类和鉴别，发现其明显差异，根据系统发育图谱，将二者结合起来，进行细菌的分类和鉴定，能够快速测定食品中的主体微生物。

2.4 基因芯片技术

用荧光素在检测杂交信号上实现对样品的快速检测，采用原位合成纤维打印手段进行标记样品的杂交。首先对各种基因进行芯片表面上的处理，通过分析荧光分布和扫描仪定量模式，在对多参数的微生物序列进行同步分析后，确定检测样品中是否存在特定分析微生物，快速进行自动检验，通过一次杂交检测从菌株的水平鉴定微生物，将芯片中的核酸杂交，按照检测要求进行探针固化，检测得出食品中的微生物分布，有助于分析总结有害微生物的特征[5]。

2.5 高通量测序技术

因其数字化信号、高数据通量、高测序深度和高准确性等特点，被广泛应用于微生物群落的研究中，能检测出新的菌株，目前的生物信息学分析也可以基于16S rDNA的测序，对代谢途径和微生物群落的基因构成进行预测分析。

2.6 宏基因组学

高通量测序和生物信息学分析，是近年发展起来的新技术，科进行功能基因筛选鉴定。宏基因组可提供大量的、无法估计的基因信息，是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，直接提取环境样品中的宏基因组及寻找和发现活性代谢产物和新的功能基因的一种方法。宏基因组技术路线为：不经过分离培养微生物，对环境中微生物群体总DNA进行提取。宏基因组文库的构建，以测序分析和功能基因筛选为研究手段，了解了微生物群落潜在功能，成为菌群多样性和功能相结合的研究工具。

3 结语

近年来，我国曝光了一系列的食品安全事件，造成了严重的消费者恐慌，导致对食品安全问题的关注度逐渐提升。微生物污染作为一项严重的食品污染问题，可能导致食物变质，引发食物中毒，为了避免这一现象，应采取科学、合理的方法对食物进行检测，以保证食物安全。分子生物学方法与食品病原微生物传统检测方法相比具有良好的优势，大大提高了食品微生物检测水平。