禽法氏囊、腺病毒二联灭活疫苗的制备与检验

吴卫东 魏中锋 徐梅 岳立

（1，山东省菏泽市食品药品检验检测研究院 274000；2，山东省菏泽市动物疫病预防控制中心 274000）

鸡传染性法氏囊病是一种重要的鸡免疫抑制病［1］，目前国内同时存在经典毒株、变异毒株和超强毒株，经常导致鸡群的免疫失败，给禽业养殖造成重大的损失［2］。为了有效防治鸡传染性法氏囊病制备了法氏囊、腺病毒二联油乳剂灭活疫苗，经过试验检验有效性良好。

1 材料

1.1 毒株

禽法氏囊、腺病毒疫苗毒株由本实验室分离鉴定的当地流行毒株。

1.2 试验动物

SPF 鸡胚、SPF 鸡购自山东农业科学院SPF 鸡场。

1.3 主要试剂

注射用白油购吉化江城油脂化工有限责任公司；硬脂酸铝、司本-80、吐温-80 均购自湖北江民泰华化工有限公司湖北江民泰华化工有限公司。

1.4 主要仪器

型号为FSH-2 可调高速电动匀浆器购自金坛市天竟实验仪器厂。

2 制备方法

2.1 病毒抗原的制备与检验

2.1.1 种毒增殖

将禽法氏囊、腺病毒疫苗毒株分别用灭菌0.9%生理盐水1000 倍稀释后，通过卵黄囊接种 7～9日龄 SPF 鸡胚 200 枚，0.2ml/胚，SPF 鸡胚必须是经检测无禽法氏囊、腺病毒感染史和免疫史，37℃孵育48～120h，在此过程中无菌收集死亡鸡胚的尿囊液，存放于-20℃保存。

2.1.2 种毒含量的测定

将种毒增值后的尿囊液用灭菌生理盐水依次进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 倍稀释，取每个稀释度的病毒液经卵黄囊途径分别接种7～9日龄SPF 鸡胚16枚，接种量为0.1ml/胚，将接种的鸡胚置于37℃按照孵化技术孵育168h，进行每天记录死亡鸡胚数量，按照Reed-Muench法计算增值种毒液对SPF 鸡胚的半数致死量（ELD50）。

2.1.3 种毒液灭活

将增殖后的种毒液加入最终含量为0.1%甲醛搅拌均匀后，放置于60℃水浴锅中灭活3h，种毒液经甲醛灭活后置2～4℃保存备用。

2.2 灭活疫苗的制备

2.2.1 油相制备

取注射用白油94 份，硬脂酸铝1 份，加热缓慢搅拌至完全融化，再加入司本-80 6 份，充分搅拌混匀后再116℃高压灭菌 30min，放置于 2～8℃保存。

2.2.2 水相制备

取高压灭菌好的吐温-80 4 份，法氏囊、腺病毒灭活抗原各48 份，混合加入，低速搅拌至两者完全溶解，置于2～8℃保存。

2.3 灭活疫苗的实验室质量检验

2.3.1 物理性状检验

（1）肉眼仔细观察灭活疫苗的颜色和性状。

（2）黏度检验，将 2～8℃保存的疫苗取出逐渐恢复至室温25℃左右，用1ml 吸管吸取制备的疫苗1.0ml，使其从吸管中垂直流出，记录流出0.4ml 所用时间是否达到标准。

2.3.2 制备疫苗的效力试验

（1）疫苗抗体效价的测定将30 只21日龄SPF 鸡随机分成3 组（对照组、低免疫组、高免疫组），每组 10 只，低免疫组、高免疫组分别在颈部皮下注射灭活疫苗0.2ml 和0.5ml，对照组注射灭菌生理盐水 0.5ml，在注射疫苗 1 周、2 周、3 周、4 周、2月、4月、6月后对各组的鸡于进行翅静脉处采血，每只鸡采血0.5ml，用离心机分离血清。将分离的血清做2 倍的梯度倍比稀释，用10 倍浓缩的法氏囊、腺病毒灭活种毒作为检测抗原，用琼脂扩散的免疫学检测方法测定每组鸡的抗体效价，用数据分析软件进行各组试验鸡数据方差分析和多重比较。

（2）攻毒保护试验。将购买的 21日龄 SPF 鸡 20 只随机分成 2 组（对照组、试验组），每组 10 只，试验组每只鸡在颈部皮下注射制备好的灭活疫苗0.5ml，对照组每只鸡注射灭菌生理盐水0.5ml。在注射21d 后采集对照组、试验组每只鸡翅静脉血0.5ml，离心分离血清，采用琼脂扩散方法测定每只鸡的血清抗体效价，然后对所有鸡点眼接种未灭活的法氏囊病毒液和肌肉注射未灭活的腺病毒液，接种量为0.1ml/只，在攻毒后每日记录每只鸡的临床症表现和发病死亡情况，对死亡的鸡解剖检验，记录病理变化，在攻毒14d 后将所有活鸡进行解剖检验，记录病理变化。

3 结果

3.1 疫苗种毒病毒含量测定结果

按Reed-Muench 法计算法氏囊、腺病毒液的病毒含量ELD50 分别为 10-5.53/0.1ml 和 10-6.17/0.1ml，表明疫苗种毒病毒液中的病毒含量较高。

3.2 种毒抗原灭活检验结果

经甲醛灭活后的法氏囊、腺病毒抗原接种7日龄SPF 鸡胚0.1ml/胚，37℃孵育 168h 后，检查鸡胚无死亡，剖检鸡胚未出现任何病变，将孵育168h 鸡胚的尿囊液盲传3 代后也未发现鸡胚死亡和剖检病变，表明种毒抗原病毒液灭活彻底安全。

3.3 疫苗临床安全性检验结果

14日龄20 只SPF 鸡在注射疫苗后，临床观察未出现任何异常情况，如减食、腹泻、呼吸道炎症等。在 14d 后，所有存活鸡解剖后，观察注射部位，注射疫苗已全部吸收，未产生疫苗吸收不良或炎症情况。

3.4 疫苗效力试验结果

3.4.1 琼脂扩散检测结果

在疫苗免疫后每周进行采血检测，试验组的抗体效价（log2）与对照组相比均显著提高（P＜0.05）。在疫苗免疫后第一周和第二周的抗体效价（log2）差异均显著（P＜0.05），在第四周后疫苗免疫每周采血检测抗体结果差异均不显著（P＞0.05）。低免疫组、高免疫组抗体效价均能在免疫28d 后的达到最高值，在维持2个月后才会出现缓慢下降情况，在注射疫苗4个月后，疫苗注射组的抗体效价仍能保持在4log2 以上。在注射疫苗6个月后，疫苗注射组的抗体效价仍处在3log2 以上。

3.4.2 SPF 鸡攻毒保护试验结果

在攻毒3d 后，对照鸡先后出现发热、精神萎靡、拉黄绿粪便等临床症状，7d 后所有对照组鸡全部死亡，解剖可见心包积液、肝脏肿大、腺胃乳头出血、法氏囊肿大出血、腿肌胸肌出血等法氏囊和腺病毒感染的典型病理变化。疫苗免疫组鸡免疫后3 周后采血检测法氏囊和腺病毒抗体效价平均值为4.40log2 和 4.52 log2，对照组为 0log2，在攻毒后 3 周内未出现死亡，结果表明，制备的灭活疫苗能完全保护法氏囊和腺病毒强毒株的攻击，灭活疫苗的免疫效果较好。

4 小结

禽法氏囊和腺病毒对目前鸡养殖业已造成重大危害，尤其在有些地区还存在禽法氏囊和腺病毒混合感染的情况，本试验以本地分离流行毒株为疫苗种毒，成功制备出了法氏囊、腺病毒二联油乳剂灭活疫苗，并经过实验室质量检验符合国家兽药典标准。