丹参酮ⅡA对脑缺血保护的作用机制研究进展*

王媛媛，陶娌娜，宋燕青，李 楠

（吉林大学第一医院药学部，吉林 长春 130021）

缺血性脑卒中的发病机制为脑血流供应障碍造成大脑缺血缺氧［1］，随着生物学技术及影像学的发展，多数证据支持其与氧自由基产生过多及消耗不足、缺血缺氧的大脑环境造成神经细胞坏死与凋亡、免疫答应与炎性反应失衡等密切相关［2-4］。丹参是唇形科Labiatae多年生草本植物，最初被收载于《神农本草经》，列为上品，具有很高的药用价值，味苦，性微寒，具有活血化瘀、祛瘀止痛、化痈清心的功效［5］。丹参酮（tanshinone）是丹参的脂溶性化合物的主要成分，其中丹参酮ⅡA（TanshinoneⅡA，Tan ⅡA）在丹参酮活性成分中含量最高，其通过抑制氧化应激反应、减轻炎性反应和抑制细胞凋亡等途径发挥药理作用，具有多靶点、多层次、多环节的脑保护功效［6-8］。在此对丹参酮ⅡA对脑缺血保护的作用机制的研究进行综述。

1 抑制细胞凋亡

1.1 概述

缺血性脑卒中是由脑血流的突然减小或完全中断造成脑组织缺氧缺糖，继而引发一系列级联反应造成的。早期脑组织缺血表现为中央缺血区域的神经细胞呈不可逆性坏死，后期表现为缺血半暗带细胞凋亡［9］。细胞凋亡是程序式过程，丹参酮ⅡA可通过抑制神经细胞凋亡而保护脑细胞，以及缩小梗死区域。

1.2 抑制凋亡诱导因子表达

抑制Caspase-3表达：半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（Caspases）以无活性的结构酶原的形式广泛存在于细胞中。目前，已知14种哺乳动物的Caspases中，约有8种被认为参与着细胞凋亡的过程，其中最关键的凋亡蛋白酶被认为是Caspase-3，在凋亡程序中占据枢纽地位［10］。缺血性脑卒中所致缺氧和缺糖细胞环境可上调Caspase-3前体的表达，引发Caspase-3前体去磷酸化，使 Caspase-3活化，加速细胞凋亡进程［11］。韩若东等［12］研究发现，大鼠脑缺血造模完成后，经染色后发现神经细胞Caspase-3阳性表达率升高，细胞凋亡数目增加，脑部梗死体积较急性发作期进一步扩大。给予丹参酮ⅡA后，Caspase-3阳性表达率降低，细胞凋亡数目减少。多项证据均支持丹参酮ⅡA通过抑制Caspase-3阳性表达而保护脑缺血后的受损神经元。

抑制Bax表达：Bcl-2和Bax蛋白是一对重要的内源性蛋白质，具有细胞凋亡的调控作用。Bax同时也是一种转录因子，参与诱导细胞凋亡的基因转录过程，而Bcl-2 具有抑制 Bax的作用［13］。Bcl-2 和 Bax蛋白的表达决定细胞的生存情况，当Bax蛋白处于优势地位时细胞死亡速度加快，而当Bcl-2蛋白处于优势地位时细胞死亡速度减慢。在大鼠局灶性脑缺血模型中，Bax蛋白由胞浆快速转移至线粒体，并与Bcl-2结合，引起线粒体膜通透转运孔的开放，释放凋亡诱导因子及细胞色素 C，推动细胞凋亡过程［13］。支文煜［14］研究发现，丹参酮ⅡA能改善缺血-再灌注引起的Bax表达增高和Bcl-2表达降低，通过抑制线粒体内促凋亡蛋白的释放发挥抗凋亡作用。

1.3 调节凋亡信号通路

神经元凋亡是由于细胞内死亡程序的启动致使细胞“自杀”的过程，呈现能量依赖性。神经元死亡程序启动后，神经元细胞体积变小，细胞通透性改变，胞质减少，细胞核固缩于边缘，DNA降解，最终形成多个凋亡小体被吞噬细胞吞噬。神经元细胞的信号传导机制十分复杂，目前认为主要信号通路分为外途径（死亡受体途径）和内途径（包括线粒体途径及内质网途径）。

线粒体通路：线粒体通路介导的神经元凋亡与缺血性脑损伤严重程度有关。严重缺血性脑损伤可造成线粒体三磷酸腺苷（ATP）合成不足，细胞能量供应不足，最终因能量枯竭导致神经元坏死。线粒体通透性转换孔（MPTP）处于线粒体内外膜之间，当细胞遭受到各种外源性刺激时，引起MPTP开放，线粒体通透性增加，线粒体中的细胞色素C被释放进入胞浆，特异性结合凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成一种多聚复合物，激活 Caspase-3［15］，被激活的 Caspase-3 通过剪切靶细胞DNA依赖性蛋白激酶等，不可逆地改变其结构，促使细胞凋亡。Bcl-2基因是一种癌基因，与其相关的膜蛋白是一种强有力的细胞凋亡抑制因子，其在调节神经元凋亡过程中发挥着关键作用。李浩等［16］采用线栓法建立局灶性脑缺血-再灌注模型，发现造模24 h后，模型组相对假手术组Bcl-2和Caspase-3表达增加。丹参酮ⅡA高、低剂量组较模型组脑组织缺血面积缩小，Bcl-2表达升高，且Caspase-3表达降低。

死亡受体通路：包括死亡因子受体（Fas）／死亡因子Fas配体（FasL）死亡通路及肿瘤坏死因子受体相关蛋白（TNFR）死亡通路。Fas是一种Ⅰ型膜蛋白，相对分子质量为45×103；而FasL是一种Ⅱ型膜蛋白，相对分子质量为37×103。Fas能与FasL特异性结合，从而迅速激活caspase-8，引发一系列级联反应，裂解DNA，致使细胞凋亡［17］。韩峰等［18］证明，丹参酮ⅡA能调控 Fas／FasL死亡通路，抑制Caspase-8的表达，减少肺肿瘤细胞A549细胞凋亡。TNFR死亡通路是通过TNF和TNFR-1的特异性结合，从而聚集受体死亡结构域。对细胞凋亡有直接和间接2种影响，一是TNFR衔接蛋白（TRADD）可诱导死亡结构域蛋白FADD的聚集，直接导致细胞凋亡；二是TNF和TNFR-1结合后，激活转录因子NF-κB和Apaf-1，相关凋亡因子被释放，间接导致细胞凋亡进程加快。ZHU等［19］发现丹参酮ⅡA可抑制大鼠缺血再灌注后核因子κB亚基p65亲和肽（NF-κBp65）的表达，从而降低Apaf-1水平，抑制细胞凋亡。

内质网通路：内质网广泛存在于真核细胞中，是细胞内重要的细胞器。内质网作为信号传导的枢纽平台，参与蛋白质合成、折叠和寡聚化，钙离子的储存，脂类及类固醇等物质的代谢、合成等过程。当细胞受到多种病理生理刺激，如氧化应激反应、缺血缺氧环境、钙离子水平失衡及病毒感染等时，内质网发生应激反应，此过程既能修复早期或损伤较轻的细胞，又能清除过度损伤的细胞，是重要的维持细胞内环境稳态的过程［20］。Parecoxib作为一种新型环氧合酶-2（COX-2）抑制剂，可抑制脑缺血再灌注损伤后内质网应激介导的神经元凋亡，控制脑缺血后缺血半暗带面积进一步扩大。DONG等［21］发现，Parecoxib可显著抑制缺血半暗带Chop表达及Caspase-12活性，进而减轻神经元凋亡，因此内质网通路和信号传导途径或可成为缺血性脑卒中等神经系统疾病的治疗新靶点。

2 抑制炎性反应

2.1 概述

脑缺血-再灌注后，氧自由基及其他信使可活化炎性细胞，释放趋化因子，上调黏附分子，白细胞黏附于血管内皮细胞，血流受阻形成“无复流现象”，微血管闭塞，同时聚集的白细胞可释放氧自由基、蛋白水解酶等作用于内皮细胞，破坏血-脑屏障，形成脑水肿，激活的白细胞在微血管内聚集，又可释放大量的炎性介质和细胞因子，使更多的中性粒细胞聚集到炎性反应部位，从而加重炎性反应，造成恶性循环［22］。丹参酮ⅡA通过抑制炎性细胞的活化及趋化因子、炎性细胞因子表达，抑制细胞及体液免疫答应，从而降低炎性反应。

2.2 抑制参与炎性反应的细胞活性

小胶质细胞：是存在于中枢神经系统中的一种免疫细胞，可实时反映大脑微环境情况，并对细胞外信号刺激有一定反应；同时，还具有吞噬表达异常细胞、细胞碎片的能力，在维持正常细胞的平衡中发挥重要作用。缺血性脑卒中造成的缺血缺氧环境可引发神经元细胞的异常表达及形态学的改变，从而激活小胶质细胞释放出多种炎性介质和细胞毒性介质，诱导细胞损伤及凋亡，最终加重脑损伤。蔡琳等［23］研究证实，丹参酮ⅡA可通过对NLRP 3炎症体信号通路中的白细胞介素1β（IL-1β）、凋亡蛋白Caspase-1及IL-18的表达产生抑制，进而发挥OGD／R的BV2小胶质细胞损伤的保护作用。

星形胶质细胞：可分泌多种炎性介质。缺血性脑卒中造成的缺血缺氧环境可导致机体启动免疫应激，活化星形胶质细胞，分泌与组织相容性较好的复合物和刺激因子，活化T辅助淋巴细胞，抑制IL-12的表达，发生免疫答应，引起炎性反应。同时，星形胶质细胞与小胶质细胞在中枢神经系统免疫反应中具有协同作用。小胶质细胞可以分泌细胞因子和氧自由基而影响星形胶质细胞活性，而星形胶质细胞经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子的活化，可以产生炎性细胞因子，两者相互作用加重缺血-再灌注后神经元炎性反应［24］。利用Zea Longa线栓法可以制造大鼠脑缺血性动脉梗死模型，神经细胞纤维化，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）分泌增多，而丹参酮ⅡA可降低GFAP水平，使受影响区域的细胞炎症及死亡进程减慢，最终发挥脑保护作用［25］。

2.3 抑制细胞因子表达

IL：IL-1有2种不同的异形体，即IL-1α和IL-1β，可结合不同的受体而发挥作用。丹参酮ⅡA可下调IL-1β表达，抑制中性粒细胞聚集、浸润脑部，降低炎性反应［26］，即给予 IL-1β 抗体，预先阻断 IL-1β 的表达，IL-6是脑炎性损伤的重要因子，脑缺血急性期时机体处于应激状态，神经、内分泌及免疫等系统均处于一种激活的状态，IL-6分泌增多，以增加机体抗损伤的修复能力，可减小大鼠脑缺血-再灌注后坏死面积，降低神经功能缺失评分，改善神经功能。孙有利等［27］的研究发现，用丹参酮ⅡA预处理后的缺血性脑卒中大鼠，IL-1β及IL-6水平均明显降低，丹参酮ⅡA发挥抗炎活性，保护神经元。

TNF-α：TNF-α通过多种途径参与脑损伤，可激活内皮细胞，促进血管收缩并维持凝血状态，进一步减小脑部血流，加重缺血性脑损伤，并提高脑卒中二次复发率；刺激急性期反应蛋白合成增加，诱发炎性反应；促进兴奋性氨基酸及一氧化氮（NO）释放，加重神经毒性。丹参酮ⅡA能下调TNF-α在体内的表达，抑制炎性反应［28］。

2.4 抑制趋化因子表达

趋化因子是一类细胞因子，相对分子质量较小。此类细胞因子在细胞间信号传导及炎性细胞招募过程中起到重要作用，分为C-X-C趋化因子和C-C趋化因子。IL-1和TNF-α均可促进趋化因子的产生、并增强其活性。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是一种趋化蛋白，在炎性反应中高表达。急性缺血性脑卒中患者脑脊液中的MCP-1表达水平明显高于健康者。给予丹参酮ⅡA治疗后，MCP-1及TNF-α明显降低，同时可改善脑缺血半暗带区白细胞浸润情况［29］。

2.5 抑制黏附因子表达

细胞间黏附分子（ICAM-1）是一种分布于全身的重要炎性因子，多存在于炎症部位的细胞表面，在白细胞的迁移和浸润过程中发挥重要作用。通常情况下，ICAM-1水平较低，而当受到如 TNF-α，IL-1β，NF-κB等炎性细胞因子刺激后，ICAM-1表达急剧升高。脑缺血后，细胞黏附因子表达升高，从而加强白细胞与内皮细胞的黏附，最终促使白细胞穿越内皮细胞到达脑实质，因此黏附过程在白细胞跨内皮迁移过程中至关重要。KAMIMURA等［30］的研究发现，丹参酮ⅡA可抑制ICAM-1的表达，抑制白细胞浸润神经细胞，从而缓解局部炎性反应，达到治疗缺血性脑卒中的目的。

3 抑制氧化应激过程

氧化应激的基本机制是体内氧化-抗氧化动态平衡被打破，细胞还原电位下降导致氧自由基大量产生，诱发氧化应激［31］。缺血性脑卒中患者产生氧自由基的过程分为三部分。首先，随着线粒体去极化水平的降低，产生大量氧自由基；其次，伴随镁离子水平升高，ATP代谢产物使黄嘌呤氧化酶被激活，产生氧自由基；最后随着钙离子水平的升高，还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化镁产生氧自由基。

提高超氧化物歧化酶活性：氧自由基是人体在利用氧时产生的损害细胞膜、蛋白质和DNA的一种分子，其不能在体内稳定存在，还会影响到体内其他分子的稳定性，造成细胞和组织的广泛性损伤，且与衰老密切相关。氧自由基转化为过氧化氢的过程需要超氧化物歧化酶（SOD）的催化，过氧化氢继续经氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶分解成为水，清除自由基的过程也是保护机体免受氧化应激伤害的过程。SOD活性间接反映了机体对抗氧化应激、清除自由基的能力。冯晶晶等［32］的研究发现，丹参酮ⅡA可显著降低缺血脑组织中脂质过氧化物（MDA）的含量，增强SOD活性，并提高ATP水平，降低氧化应激程度，减少体内自由基的形成，增加机体清除自由基的能力，并改善能量代谢障碍，这可能与丹参酮ⅡA降低缺血性脑卒中神经细胞中钙离子水平有关。

提高谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性：机体内广泛存在的清除氧自由基的催化酶，可清除由氢氧负离子、活性氧诱导形成的MDA，保护细胞膜结构的完整和细胞器功能的健全。LIN等［33］的研究显示，大鼠经脑缺血-再灌注造模后，GSH-Px活性较正常大鼠增强，推测与大鼠缺血后的代偿性反应存在一定联系，当给予丹参酮ⅡA干预后，GSH-Px活性进一步增强。表明丹参酮ⅡA可以通过提高GSH-Px水平而增强抗氧自由基效用。

4 结语

丹参可通过以下3个方面保护脑缺血组织：一是抑制炎性细胞的活化过程，减少炎性因子及黏附分子的表达与分泌，减少缺血脑组织中中性粒细胞及白细胞的浸润、聚集，减轻组织因过度的炎性反应所致损伤；二是通过抑制细胞相关凋亡诱导因子的表达，调节细胞凋亡信号通路，最终抑制受损神经细胞的凋亡，缩小脑梗死体积；三是通过提高抗过氧化物酶活性，抑制氧化应激过程，保护脑缺血细胞。以上多数理论依据建立在试验动物模型上，缺少临床证据，故应开展大样本、多中心的随机临床试验研究，以实践其基础研究的准确性。