影响RT-PCR实验结果的因素

张鹏

（辽宁省丹东市动物疫病预防控制中心 118002）

1 样品因素

（1）非洲猪瘟的靶器官是脾脏、淋巴结、肾脏、扁桃体，应选取在病变和健康组织交界处采集样品。

（2）对于腐败动物尸体剖检取股骨，将附着的肌肉和韧带等全部剔除，采集骨髓。最低建议量5g。

（3）蜱可进行核酸检测、抗原检测和蜱的形态学鉴定，查找猪圈的墙边、墙缝、木质或瓦质的屋顶，或挖掘猪圈地面均可能找到蜱，也可查看猪体表面，采集蜱。

以上3 种是常见的非洲猪瘟检测样品。为尽可能减少污染，每取一个组织块或蜱，用火焰消毒剪镊等取样器械，组织样品分别放入灭菌容器内并立即密封，做好标记，注意防止组织间相互污染。组织样品的处理应在二级生物安全柜中进行，勿使液体溅到生物安全柜中。

病毒的灭活处理应在二级生物安全柜中进行，将处理好的血清、全血或者研磨破碎后的组织样品连同EP 管放入60℃水浴中，放置30min 灭活。这样可以保证检测样品的纯净度，保证实验结果真实有效。

2 人员因素

要求PCR 的实验操作人员有很好的素质，能严格遵守操作规程，并能发现问题和解决问题。PCR 实验的操作人员除了要做好必要的个人防护之外，还要熟悉实验流程中容易出现的问题。要实行考核上岗和定期培训制度。

到不同的操作间时，要注意及时更换防护用品，在核酸提取室操作时，戴的一次性口罩、帽子、手套要勤换，避免污染。在扩增室，对于顶部采光仪器要带新的一次性PE 手套对荧光PCR 封盖，对于底部采光的仪器要避免徒手或使用过的手套接触荧光PCR 管底，检测过程中使用不带荧光物质的一次性乳胶手套。

3 仪器因素

要选择性能好的仪器。RT-PCR 实验所用的大多属于贵重仪器，荧光PCR 仪、冷冻离心机、生物安全柜、核酸提取仪，要根据仪器操作规程使用，定期维护保养，填写使用和维护记录，做好仪器状态标识，同时也要对实验室的温湿度进行监测记录，避免实验室湿度过大使仪器锈蚀。移液器要定期请计量部门进行校正，各室都要有一套完整移液器，互相不能调换使用。

4 试剂因素

试剂质量直接影响实验结果，所以要选用高质量的PCR 试剂。采购的试剂必须有国家正式的批准文号，认真查看试剂批号和有效期。实验室对每批购进的试剂要进行校对实验，质量验收合格后方可使用。

试剂盒，待检样品以及试验中使用的氯仿、异丙醇等试剂要分区存放，不能存放于同一个冰箱内，避免污染。

冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底，吸头尽量在液体表层吸取，使用后立即放回-20℃。反复冻融不超过3 次，以免影响试剂性能。

5 实验因素

（1）实验室应严格按照有关规定分区管理，依照样品前处理区—核算制备区—扩增区—分析区顺序进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。

（2）核酸提取时要认真按照试剂使用说明书一步一步进行，防止试剂和样品受到污染，开离心管时要用双手，动作要轻，防止液体溅出。加样时最后加阳性对照，减小阴性对照和样品被污染的概率。非洲猪瘟试验需要2 组阴阳对照：提取阳性对照（E+）、提取阴性对照（E-）、反应阳性对照（R+）和反应阴性对照（R-）。

（3）配液时一般要多比反应需要的样品数量配出2 份，由于加样量非常小，所以加样时，吸头不要碰倒离心管的管壁，样品加入后，应在液面以下轻轻吹打几次混匀。

（4）扩增时用将8 连管竖直放正，确保每个管内液体平稳在管底，无挂壁，无气泡。带PE 手套操作，不能用裸手接触管盖或管底。实验结束后，要将管从仪器中取出。

总之，影响RT-PCR 实验准确性的因素有很多，实验室只有不断提升检测人员的能力，加强控制检测方法和检测过程，定期开展样品比对实验才能有效提高实验的准确率。