高效液相色谱法在白酒分析中的应用

安明哲，廖勤俭，李杨华，罗 珠

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644000）

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，以下简称HPLC）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。白酒的分析检测不仅可以帮助人们认识白酒，在食品安全中也起着至关重要的作用，比如重金属、塑化剂等物质的含量在酒类行业中有严格的要求，这就要求检测手段必须具有很高的精密度。HPLC在白酒中的运用时间长，方法成熟，已被广泛运用在白酒的醇类、酯类等物质的检测中。本文总结了近年来HPLC在白酒中的分析检测运用，以提供白酒中微量物质检测手段的参考。

1 HPLC在甜味剂分析中的应用

在白酒中加入甜味剂以增加白酒的甜味和回甜感以改善口感，成为了许多不法生产商的潜规则。广泛应用的人工合成甜味剂主要包括甜蜜素、阿斯巴甜、糖精纳等，甜味剂在各种香型的白酒国家标准中禁止添加[1-4]。食品行业中检测甜味剂的方法有气相色谱法、高效液相色谱法、超高效液相色谱-质谱联用法和离子色谱法等，最新食品安全国家标准GB 5009.247—2016规定了食品中纽甜测定的高效液相色谱法[5]。其前处理过程包括混合提取液提取、固相萃取柱净化、氮吹浓缩等步骤。

考虑到国标提供的食品中纽甜测定方法的复杂性，刘石雪等[6]对高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量的各个影响因素进行了探究，优化了实验条件。最后采用Agilent C18色谱柱（5μm,150 mm×4.6 mm），流动相为乙腈-离子对试剂缓冲液，紫外检测器波长210 nm，柱温30℃，流速1 mL/min测定白酒中的甜味剂。此方法中，纽甜浓度在0.16～25μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，检出限0.06μg/mL，加标回收率在93.75%～98.13%之间。实验结果表明，此方法分离度较好，操作稳定，数据准确，适用于白酒中纽甜的检测。马雪丰等[7]研究建立了同时测定白酒中6种甜味剂安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、甜菊糖苷、纽甜、阿力甜的高效液相色谱分析方法。从样品前处理方法、检测波长、流动相梯度的不同条件的选择，最终确定以ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）为色谱柱，乙腈-乙酸铵（20 mmol/L）为流动相进行梯度洗脱；采用外标法进行定量分析。6种甜味剂能在25 min内完成分离，在5～100μg/mL范围内质量浓度与峰面积具有良好的线性关系（相关系数＞0.9999）。该方法的检出限低，在3个加标水平下，样品平均回收率在87.0%～103.1%，相对标准偏差＜3%。该方法简便、快捷、准确，可用于白酒中6种甜味剂的同时测定。

优化白酒中甜味剂高效液相色谱的检测方法，可以为精确测定微量甜味剂提供可靠有效的检测保障。

2 HPLC在酸类化合物分析中的应用

酸类化合物是酒的重要风味物质，白酒中的有机酸对酒的性质有着较大的影响，其种类和数量决定着白酒的品质和口感。酸量少，酒味淡，后味短；酸量大，酸味露头，酒味粗糙。适量的酸可对酒起缓冲作用，并在贮存过程中能缓慢地形成酯。酸对酒的甜度也有影响，太酸的酒使酒的“回甜”减弱。优质白酒的酸含量较高，一般高于普通白酒1～2倍。因此，酸的含量适中对于白酒的质量起着举足轻重的作用，对酸类化合物的准确定性和定量也成为白酒行业中重要的课题。白酒中酸类物质的分析方法主要有气相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、高效液相色谱法等。

刘露等[8]利用高效液相色谱法分析白酒中的琥珀酸，色谱柱为Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm×1.7μm）；流动相为0.02 mol/L KH2PO4，pH2.3，用0.22μm滤膜过滤；检测波长210 nm；柱温箱30℃；流动相流速：0.2 mL/min；进样量：10μL。结果显示，保留时间为2.1 min，线性相关系数R2=0.999，精密度为1.17%，加标回收率在89.0%～101.8%之间，满足分析方法要求，优化后的方法样品前处理方式简单，分析样品时间短，便捷高效，能够较好地对白酒中琥珀酸定性定量分析。方毅菲[9]首次利用高效液相色谱分析豉香型白酒中的二元酸，采用的方法是DM-2大孔吸附树脂或等效大孔吸附树脂提纯、Ultimate AQ-C18色谱柱、梯度洗脱、紫外检测器进行二元酸的液相色谱分析和外标法定量等技术的结合，结果显示，二元酸的线性范围为0～80 mg/L，R＞0.999，RSD＜3%，样品回收率为100%±5%。余剑霞[10]利用高效液相色谱法测定豉香型白酒中微量的高级脂肪酸，测得亚麻酸、肉豆蔻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸的相对标准偏差分别为0.84%、0.42%、0.42%、0.77%、0.22%和3.07%，回收率为91.4%～105.5%，线性范围为0～50 mg/L，r≥0.99954。王芳等[11]建立了利用高效液相色谱仪同时检测乳酸、乙酸、丁酸、己酸的方法；冯向东[12]建立了高效液相色谱法测定白酒中乳酸和乙酸含量的方法；李斌等[13]建立了高效液相色谱法测定浓香型白酒中乳酸含量的方法；张宝玉[14]建立了高效液相色谱法测定酒醅中乳酸含量的方法；魏志阳等[15]对高效液相色谱法（HPLC）测定清香类酒醅中主要酸类物质的方法进行了研究，通过对流动相、流速及酒醅中主要酸类物质提取条件（乙醇浓度、提取时间）的优化，建立了HPLC同时测定酒醅中乳酸和乙酸的方法。庄俊钰等[16]采用活性炭(ZS-207)净化法前处理白酒样品测定了豉香型白酒中的乳酸含量，此方法简单易操作，净化效果好。

酸类物质是白酒中最重要的微量物质成分之一，精确地分析其成分可以为控制白酒质量提供依据。

3 HPLC在酯类化合物分析中的应用

白酒原粮中含有大量的蛋白质，蛋白质水解后生成氨基酸，经过发酵或者糖化作用生成大量的醇类化合物，醇类化合物与有机酸在酯化反应的作用下合成多种酯类化合物，使白酒具有独特的香味[17]。

徐静[18]利用五粮液成品酒作为样本，选择固相微萃取作为前处理方法，采用直接进样法，建立了乳酸乙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯的液相色谱分析方法，该方法流动相体系简单，无需前处理，方便快捷，通过与气相色谱方法的实验结果对比，建立的高效液相色谱法准确、灵敏、快速。张房宇[19]建立了反相高效液相色谱法同时测定米香型白酒中乳酸乙酯、乙酸乙酯的方法，酒样无需任何处理直接入样。相关系数分别为r=0.99986和r=0.99979；样品浓度采用外标法测定，回收率分别为98.5%～101.9%和98.1%～101.7%；最低检出质量浓度分别为0.34 mg/L和0.44 mg/L；该法具有准确度高、灵敏度高、重现性好等优点。魏志阳等[15]通过对流动相、流速及酒醅中主要酯类物质提取条件（乙醇浓度、提取时间）的优化，建立了HPLC同时测定酒醅中乳酸乙酯和乙酸乙酯的方法。王群等[20]建立了高效液相色谱法同时测定芝麻香型白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯四大酯类的方法，酒样不需要繁琐的处理，经过滤膜过滤后即可直接进样。

4 HPLC在吡嗪类化合物分析中的应用

吡嗪类化合物是一类含1，4-二氮杂苯母环化合物的总称，广泛存在于自然和发酵食品中，具有类似于炒坚果、烤肉的怡人香气，香气透散性好，对其他香味有显著的烘托和叠加作用。四甲基吡嗪（又称TTMP）是一种重要的吡嗪化合物，其测定方法有气相色谱法，液相色谱法和气相色谱-质谱联用法。

司冠儒等[21]利用HPLC快速检测芝麻香型白酒中TTMP，以甲醇∶水（v/v）=35∶65作为流动相，选用phenomenex Gemini C18柱，在278 nm波长下检测。结果表明，样品回收率为94.67%～100.33%，相对标准偏差为3.29%～1.77%。此方法操作简便，具有较好的准确性和重复性。司冠儒等[22]对比了气相色谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱联用法检测芝麻香型白酒中TTMP的方法，并对3种方法检测TTMP的回收率和精密度进行了研究。结果显示，3种方法的回收率和精密度都满足检测的要求。但液相色谱法的优势明显，TTMP响应较高，出峰前后没有其他风味物质的干扰，且样品无需前处理直接进样，操作简便，对仪器设备和技术人员的素质要求较低，便于推广。

5 HPLC在有害物质分析中的应用

5.1 HPLC在塑化剂分析中的应用

随着白酒行业中“塑化剂事件”的曝光，人们开始关注白酒塑化剂的安全问题。塑化剂（增塑剂）是指邻苯二甲酸酯类物质（phthalicacid esters,PAEs），是一种高分子材料助剂，被广泛应用于食品接触材料中。塑化剂挥发性低，稳定性高，易溶于有机溶剂，属干扰生物体内分泌的化学物质[23]，对人体极其有害。白酒中塑化剂的来源包括原料中、生产加工过程中的塑料容器、运输、存储过程中的各个因素和非法添加等[24]。蔡英翔等[25]利用HPLC色谱分析法法测定白酒中的6种邻苯二甲酸酯类物质，检出限低，加标回收率好。郭丽萍等[26]采用高效液相色谱大体积进样法测定白酒中7种邻苯二甲酸酯类物质，方法简便，效果好。曹江平[27]建立了利用分散液液微萃取-高效液相色谱法测定白酒中的酞酸酯含量的方法。

5.2 HPLC在氨基甲酸乙酯分析中的应用

氨基甲酸乙酯（EC）又名尿烷，是一种产生于发酵食品和饮料酒中的化合物，主要是在发酵、蒸馏和贮存时形成。20世纪初期，EC曾用于麻醉剂，到20世纪40年代，研究者发现EC具有致癌性。1974年，世界卫生组织（WHO）的国际癌症研究所（IARC）把EC定为2B类致癌物，随后又于2007年3月将其由2B类致癌物提升为2A类致癌物，即对动物有致癌作用，对人类可能有致癌作用[28]。

肖美兰等[28]采用高效液相色谱技术检测特香型白酒中氨基甲酸乙酯（EC）的含量，研究了不同发酵周期生产的基酒中EC的含量。

6 结论

高效液相色谱作为白酒分析中常用的一种仪器设备，除能够准确地分析白酒中的甜味剂、酸类、酯类和塑化剂外，还可以分析白酒中其他物质。寻思颖等[29]利用酚类物质的荧光特性和手性拆分剂β-环糊精拆分重叠峰，建立带荧光检测-高效液相色谱仪法测定酱香型白酒中10种挥发性酚类物质含量的方法。陈清艳等[30]通过对白酒中酪醇的高效液相色谱分析方法中检测波长和流动相进行研究，建立了相应的检测方法。王春利等[31]建立了白酒中8种生物胺残留的高效液相色谱分析方法。白酒中的微量物质众多，各种类型的微量物质组成了不同香型白酒的独特风味。建立准确、操作简便、灵敏度高的检测方法，对于提高白酒产品质量、保障白酒安全、协助政府加强酒类市场监管方面具有重要意义。