丁酸梭菌的生理功效及其在猪业生产中的应用

张吉鹍

（福建中农牧生物药业有限公司，福建 厦门 361022）

1 丁酸梭菌的生理功效

1.1 调节肠道菌群平衡，促进肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的生长

动物肠道菌群失衡会引发各种肠道疾病。丁酸梭菌作为一种厌氧的内生芽孢杆菌，比需氧菌更能够适应宿主肠道内环境，从而能更加有效地促进宿主肠道内包括嗜酸乳杆菌、拟杆菌、双歧杆菌、粪杆菌、粪链球菌以及乳酸菌等在内的益生菌的增殖[1-4]，并能有效地抑制宿主肠道内包括葡萄球菌、伤寒沙门菌、腐败菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、霍乱弧菌、念珠菌以及克雷伯菌的生长，同时还能够减少吲哚类、硫化氢以及胺类等有害物质的产生[5-6]，在宿主肠道内起着整肠、治疗肠道炎症、调节菌群平衡、促进动物生长的多重作用[7-8]。曹广添等[5]将丁酸梭菌分别与大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌、双歧杆菌按不同的比例混合后进行培养，并与各菌种单独培养进行比较发现，经36～48 h培养后，联合培养组大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌菌数均显著低于单独培养组（P＜0.05）；当菌数比例为 1～100∶1 至 100∶1 时，丁酸梭菌对沙门氏菌均有较强的抑菌作用；当丁酸梭菌与其它菌的比例为100∶1时，丁酸梭菌对大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抑制作用最强；当丁酸梭菌与其它菌的比例为10∶1时，丁酸梭菌对乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效果最好。联合培养8 h后，菌数比例为10∶1时，丁酸梭菌对双歧杆菌的增殖效果最明显。赵熙等[9]的研究结果不仅验证了丁酸梭菌制剂可以显著地增加肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌的数量，而且还能有效地调控肠道微生物生态环境。由此可见，丁酸梭菌一方面通过促进益生菌增殖，另一方面通过抑制致病菌的生长来校正宿主肠道菌群的失衡，从而改善肠道微生态环境，降低腹泻率、减少肠应激综合征与胃肠炎等疾病的发生。

正常健康动物粪便所含的菌群，以双歧杆菌等厌氧菌为主。当动物患病，导致肠道菌群失调时，粪便菌群中占比较高的双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的含量减少，而占比较少的潜在致病性菌梭菌却显著增加。当患病动物经服用丁酸梭菌治愈后，其所排出的粪便中，所含的菌种（如双歧杆菌、乳酸菌、无芽孢厌氧菌、肠球菌、大肠菌等菌类）及其含量与健康动物相似，主要表现在宿主肠道菌群中占比较高的双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的比例显著增加，而潜在致病菌性梭菌的比例显著下降，临床症状明显改善[10]。郑有秀等[11]报道，在（25日龄）断奶仔猪饲粮中，添加250 mg/kg丁酸梭菌，即可有效抑制断奶仔猪盲肠大肠埃希菌和沙门菌等有害菌的增殖（P＜0.05），增加乳酸菌与双歧杆菌的数量（P＜0.05），综合考虑包括仔猪腹泻率在内的仔猪生长性能、肠道结构、肠道菌群与免疫功能等各项指标的改善，建议在25～55日龄断奶仔猪饲粮中丁酸梭菌的添加水平以250～500 mg/kg为宜[10]，但要缓解仔猪的氧化应激，丁酸梭菌的添加水平必须到达500 mg/kg[11]。Kuroiwa等[12]发现，丁酸梭菌能与双歧杆菌、乳酸菌和粪杆菌等肠道有益菌共生，其培养滤液中含有能促进双歧杆菌生长的因子，能够促进双歧杆菌等有益菌的生长；当将丁酸梭菌与致病菌混合培养时，会对弗氏志贺菌、霍乱弧菌与嗜水气单孢菌的生长产生抑制作用；当将丁酸梭菌与产胺和氨的腐败梭菌共同培养时，可抑制产胺和氨腐败梭菌的生长繁殖，从而减少肠道内有害的胺与氨的产生，进而减少宿主的中毒或器官的病理性变化。张达荣等[13]采用丁酸梭菌治疗肠易激综合征动物的菌群失调，发现经治疗的动物：一方面，其肠道内菌群与健康动物无显著差异，其中尤以双歧杆菌与乳酸菌的比例增加明显，而潜在致病性梭菌的比例则显著下降（P＜0.05）；另一方面，其粪便菌群中的大肠菌、无芽孢厌氧杆菌、双歧杆菌、乳酸菌和肠球菌等菌的含量均达到健康动物的标准，其中以双歧杆菌与乳酸菌的比例增加最为明显，而具有潜在致病性的梭菌的比例则显著下降（P＜0.05），临床症状相应改善。

1.2 增强免疫功能，预防肿瘤发生

丁酸梭菌具有提高机体的免疫力、降低饲料中的抗营养因子的作用。给动物饲喂丁酸梭菌，动物体内血清中免疫球蛋白IgA和IgM的含量增加。丁酸梭菌的细胞壁组分及其产生的胞外多糖（半乳糖∶葡萄糖=13.5∶86.5）具有抑制肿瘤细胞生长的作用。用热灭活丁酸梭菌制成的疫苗能够激活NK细胞与巨噬细胞。用ELISA法测定摄食丁酸梭菌死菌体（109CFU/g）鸡血清中免疫球蛋白IgA的含量，试验组为6 μg/mL，要显著高于未摄食菌体的对照组（0.5 μg/mL，P＜0.05）。给鸡饲喂添加有丁酸梭菌制剂的饲料后，观察其血清中ND-HI抗体效价的变化。1周后，供试鸡的ND-HI滴度迅速上升。丁酸梭菌还具有抗肿瘤作用。分别给移植肉瘤180前、后小鼠的腹膜注射丁酸梭菌液剂，发现丁酸梭菌产生的胞外可溶性多聚糖，能够抑制肉瘤的生长。用热杀死丁酸梭菌后制成的菌体疫苗，对BDF鼠的B16-F10黑素瘤具有抗转移作用[14]。

1.3 在肠道产生益生产物

1.3.1 酶 丁酸梭菌在动物肠道内既能产生多种帮助动物消化的胞内酶，又能分泌大量帮助动物消化的胞外酶。这些酶种中主要的有蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶、脂酶、糖苷酶等，对宿主所采食的营养物质的消化吸收具有重要的促进作用。例如，α-淀粉酶能够水解α-1，4糖苷键，从而可以将多糖水解成D-葡萄糖、麦芽糖、糊精和寡糖。β-淀粉酶能够作用于淀粉的非还原性末端，每次从淀粉大分子上水解下一个麦芽糖分子[15]。在α-淀粉酶与β-淀粉酶的共同作用下，把宿主肠道中的多聚糖转化为低聚糖，为肠道益生菌的生长提供必需的营养物质，从而促进其增殖。特别是日本学者Nakajima等[16-17]发现的丁酸—拜仁梭菌组菌产生的裂解酶与果胶甲基化酶，用于内切和外切果胶，将肠道中的果胶酶解为可被双歧杆菌等益生菌利用、并促进其增殖的中间产物—寡聚半乳糖、4，5-不饱和半乳糖醛酸，最终酶解为可被机体吸收利用的主要由乙酸和少量丁酸与甲酸组成的挥发性短链脂肪酸（SCFA）。这样动物每天摄入体内的大量纤维和果胶物质，由于有这些酶系的作用，均能被机体很好地吸收利用。姜芳芳等[18-20]采用Folin酚法测定酶活，就丁酸梭菌C.L24的产蛋白酶条件进行了优化，确定了其培养液的最佳碳源是可溶性淀粉，最佳氮源为酵母膏，最佳培养液起始pH为7，最佳培养温度37℃，最佳接种量为2%，最佳培养时间为48 h。在此条件下，菌株C.L24产蛋白酶的活力最高可达68.46 U/mL，比其初始酶活49.54 U/mL提高了38.2%。

1.3.2 维生素 丁酸梭菌在肠道内能够合成维生素B1（又名硫胺素、抗神经炎素）、维生素B2（核黄素）、维生素B3（又名烟酸、维生素PP）、维生素B5（又名泛酸、遍多酸）、维生素B6（吡哆醇）与维生素B9（叶酸）等B族维生素以及维生素K（凝血维生素）等维生素类物质，同时还能促进维生素E的吸收，增强动物机体的抗病力，对机体具有保健作用。用对维生素K缺乏高度敏感的家禽进行的试验表明，丁酸梭菌能够在肠道内产生动物必需的维生素K[4，6]。需要指出的是，丁酸梭菌较其它菌种能够合成更多的B族维生素，尤其是合成的烟酸是其它菌种的3～6倍[4]。这些维生素可提高饲料的利用率与动物生产性能。

1.3.3 以丁酸为主的短链脂肪酸 丁酸梭菌在肠道内能够产生丁酸等短链脂肪酸[19-20]，而以丁酸为主。据报道，大肠不同部位的肠黏膜细胞均以丁酸作为优先利用的主要能量来源，其次是谷氨酰胺与葡萄糖[21]。丁酸等短链脂肪酸不仅可以促进有益菌的生长，抑制致病菌的增殖，而且可以作为肠道绒毛生长的直接能量来源或肠道损伤修复与上皮组织细胞再生的重要营养物质，促进肠绒毛的发育[22]。小肠绒毛长度和隐窝深度等是评价小肠消化吸收功能的重要指标。刘婷婷等[3]发现饲粮中添加丁酸梭菌可以提高断奶仔猪十二指肠及回肠的绒毛长度，降低其隐窝深度，表明丁酸梭菌能够改变肠道结构，从而提高肠道的营养吸收效率。

2 丁酸梭菌的抑菌作用

2.1 单个菌种的抑菌作用

丁酸梭菌对一些常见有害菌具有抑制作用。唐宝英等[23]研究证明，丁酸梭菌在体外对猪大肠杆菌、鸡大肠杆菌与鸡白痢沙门菌有较强的颉颃作用。同时丁酸梭菌还能够抑制霍乱弧菌的生长[8]。Akahashi等[24]将丁酸梭菌Miyairi 588与致病性大肠杆菌O157∶H7共同培养，发现丁酸梭菌不仅可以抑制致病性大肠杆菌的生长，减少类志贺氏毒素（Stx）的产生，并且可以抑制大肠杆菌对Caco-2细胞的黏附；在小鼠模型中，观察到丁酸梭菌可有效降低致病性大肠杆菌所致的病死率，减少粪便中类志贺氏毒素Stx1和Stx2的含量。王腾浩等[25]的研究表明：青霉素类、头孢类和四环素类抗生素对丁酸梭菌ZJU-F1的抑菌作用较强，在饲料生产中不宜配伍；丁酸梭菌ZJU-F1对多肽类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素耐受性较强，在动物生产中可以配伍。

2.2 复合菌种的抑菌作用

鼠李糖乳杆菌属于乳杆菌，不仅具有较强的耐酸与耐胆碱力[6]，而且还具有抑制有害菌[27]与抗氧化活性的作用，并且能够调节机体的免疫功能。目前丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌均被广泛用作饲料添加剂。张玲等[6]的研究表明，将丁酸梭菌与来自于肠道中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌与大肠杆菌等4种致病菌混合培养，可将这些致病菌的菌落数降低3～5个数量级，表现出明显的抑菌作用；但当丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌组成复合菌，再与这4种致病菌混合培养，这些致病菌的菌落数仅降低3～4个数量级，表明丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌在抑菌方面，不存在正的组合效应，也就是无协同作用。

2.3 饲粮中预防性地添加丁酸梭菌

目前丁酸梭菌在生产上的使用主要是预防性地添加到动物饲粮中，但预防性添加的丁酸梭菌对健康机体在急性应激致损时的应用效果鲜见报道，预防性添加能否帮助健康宿主缓解急性应激损伤还有待进一步研究。吴杰等[28]研究了丁酸梭菌对健康大鼠生长性能及脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）致急性应激大鼠肠道结构、肠道二糖酶活性及肠道炎症的影响，发现饲粮中添加0.05%丁酸梭菌对健康大鼠的生长无负面影响，给大鼠饲喂预防性剂量的丁酸梭菌可抑制LPS急性应激下LPS对肠道蔗糖酶活性的降低，缓解LPS对肠道黏膜结构（绒毛高度和隐窝深度）的破坏，提高宿主肠道免疫功能，降低肠道炎症。

3 丁酸梭菌调节肠道菌群的作用机制

丁酸梭菌调节肠道菌群结构，是多因素综合作用的结果，其机理较复杂，其中一个重要的作用机理就是丁酸梭菌所产生的丁酸梭菌素这种蛋白质类抗菌物质，对梭状芽孢杆菌等致病菌的杀灭作用。丁酸梭菌素最先由威尔士阿伯里斯特威斯大学学院的Clarke等[29]从丁酸梭菌NCIB7423菌株中分离到，命名为丁酸梭菌素7423，而且是在对数期生长的丁酸梭菌NCIB7423分泌的丁酸梭菌素最多。Konisky[30]指出，丁酸梭菌素是一种疏水的细菌素，经丁酸梭菌处理的细胞，其DNA、RNA和蛋白质的合成受到抑制，且其F1F0-ATPase活性也受到抑制，导致ATP浓度降低，细胞内的钾离子（K+）外流。巴斯德梭状芽孢杆菌经过量的丁酸梭菌素处理后，其细胞膜的通透性改变，细胞内的代谢产物和一些离子流出胞外。如用丁酸梭菌素处理已吸收铷离子（86Rb+）的梭状芽孢杆菌，则86Rb+迅速地从细胞内流出。在非致死量低浓度丁酸梭菌素作用下，巴斯德梭状芽孢杆菌的K+外流但不影响膜电势的变化；在致死或超致死浓度的丁酸梭菌素作用下，巴斯德梭状芽孢杆菌的膜电势被消除，K+的主动吸收也被破坏[31]。关于丁酸梭菌素的分子结构、作用机制及其抗菌谱等，目前还了解得不是很清楚。Kuroiwa等[12]的研究表明，丁酸梭菌之所以能够促进肠道有益菌的增长，是因为：①丁酸梭菌在肠道中产生的淀粉酶，将淀粉水解成低聚糖，供乳酸菌与双歧杆菌利用，从而增加了乳酸菌与双歧杆菌的数量；②丁酸梭菌不能分解蛋白质，因此也就不会产生氨、硫化氢与吲哚等有害物质，也就不会引起宿主中毒或器官的病理性变化；③丁酸梭菌增殖快，能够产生大量有机酸（丁酸、醋酸与乳酸等），降低肠道pH，使有害致病菌生长受限。

4 丁酸梭菌制剂在猪业生产中的应用

4.1 丁酸梭菌单菌制剂在猪业生产中的应用

耿正颖等[32]在仔猪饲粮中添加 1×109～5.0×109CFU/kg丁酸梭菌，不仅提高了断奶仔猪的抗氧化能力与免疫功能，而且提高了仔猪断奶阶段的抗应激能力与健康水平。邢帅等[33]给仔猪饲喂添加有0.05%丁酸梭菌的饲粮，不仅改善了仔猪的肝肾功能，缓解了仔猪因大肠杆菌病引起的应激，而且增加了血清总蛋白水平，提高了仔猪的生产性能，体现在采食量与日增重的显著增加。王柳懿等[34]发现，在断奶仔猪饲粮中添加5×1011CFU/kg丁酸梭菌，不仅血清中肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）与白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）的含量呈增加趋势，而且回肠的Toll样受体2/4（Toll-like receptors 2/4,TLR 2/4）的表达量显著增加（P＜0.05），特别是处于TLR2/4信号通路下游的接头蛋白髓样分化因子（Myeloid differentiation factor 88,MyD88）以及 Toll相互作用蛋白（Toll interacting protein,Tollip）与B细胞淋巴瘤因子3（B cell lymphoma factor 3,Bcl3）的表达量亦显著增加（P＜0.05）。说明饲粮中添加的丁酸梭菌，激活了TLR2/4信号通路，使仔猪处于免疫激活状态，从而提高了机体的免疫力。何婷等[35]的研究证明，生长猪饲粮中的蛋白质水平与丁酸梭菌（1×108CFU/kg）的互作能够调节血液脂肪酸的组成，指出在研究猪饲粮中添加丁酸梭菌的效果时，应该考虑基础饲粮蛋白质与蛋氨酸水平对试验的影响。在断奶仔猪饲粮中添加1×1011CFU/kg的丁酸梭菌可有效增加断奶仔猪的体增重与饲料转化率[36]，当在添加1×1011CFU/kg丁酸梭菌的基础上，再添加1×1012CFU/kg的粪肠球菌时，可降低断奶仔猪的腹泻率[37]。其可能机制是，添加的丁酸梭菌通过影响肠道微生物及其代谢产物，激活肠上皮细胞的NOD样受体（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRs），进而促进肠上皮细胞的增殖与抗菌肽的分泌以及细胞间紧密连接蛋白、分泌型免疫球蛋白A、调节细胞因子的表达，从而提高动物肠道的屏障功能与免疫功能，以维护肠道健康[38-39]。李玉鹏等[40]发现，在断奶仔猪饲粮中添加丁酸梭菌5×108CFU/kg，能够调节肠道菌群平衡与机体免疫功能，表现在：①肠上皮细胞紧密连接蛋白mRNA的相对表达水平以及血清中抗炎性细胞因子白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）的含量显著增加（P＜0.05）；②血清中促炎性细胞因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）的含量显著降低（P＜0.05）；③断奶仔猪的肠黏膜屏障功能以及机体的抗炎症反应明显改善（P＜0.05）；④断奶仔猪的生长性能（日增重）明显提高（P＜0.05）。

4.2 丁酸梭菌复合菌制剂在猪业生产中的应用

凌欣华等[41]报道，在保育猪饲粮中分别添加由丁酸梭菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合丁酸梭菌制剂（含活菌数≥4×1012CFU/kg）2×109CFU/kg（低剂量的 A 组，500 g/t）、2×109CFU/kg（高剂量组的B组，1 000 g/t），并与由杆菌肽锌+硫酸黏杆菌素组成的复合抗生素组（1 000 g/t）C及既不添加复合丁酸梭菌制剂又不添加复合抗生素的空白对照组D进行对照，考察复合丁酸梭菌制剂防治仔猪腹泻的效果，发现在试验的第1～16天，低剂量复合丁酸梭菌制剂组A的腹泻率比空白对照组D降低 45.68%（P＜0.05），高剂量复合丁酸梭菌制剂组 B的腹泻率比空白对照组 D 降低 51.44%（P＜0.05），但组A与组B的差异不显著（P＞0.05）。在试验的第1～30天，组A的腹泻率比组D的降低52.05%（P＜0.05），然而，尽管组B的腹泻率仅比组D的降低37.22%，但差异显著（P＜0.05），而组 C 的腹泻率比组D 降低 64.15%（P＜0.05），但是组 A、组 B 与组 C 之间差异不显著（P＞0.05）。该试验表明，在仔猪饲粮中添加复合丁酸梭菌制剂2×109CFU/kg（500 g/t）就能达到2倍剂量（1 000 g/t）复合抗生素防治仔猪腹泻的效果。杨玲等[42]分别用复合益生菌制剂（含丁酸梭菌≥5×108CFU/g、地衣芽孢杆菌≥1.5×1010CFU/g、枯草芽孢杆菌≥1×1010CFU/g、嗜酸乳杆菌≥1×108CFU/g）替代断奶仔猪饲粮中0、50%、100%的抗生素（金霉素75 mg/kg+杆菌肽锌40 mg/kg+吉他霉素50 mg/kg），结果表明，在养猪生产中，可用含有丁酸梭菌的复合益生菌替代抗生素，且以100%替代效果最好。