调节性T细胞在移植物抗宿主病免疫治疗中的研究进展

于吉峰

郑州大学第一附属医院血液科郑州450052

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)是异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后供者免疫活性细胞介导的攻击宿主细胞和器官的一种过度炎症反应，它是allo-HSCT后最常见的并发症，也是影响移植效果的主要障碍［1］。调节性 T细胞(regulatory T cells，Tregs)是一类具有免疫调节作用的CD4+T细胞亚群，自从被Sakaguchi等［2］发现以来，一直是免疫学领域研究的热点。Tregs通过细胞间直接接触并分泌抑制性细胞因子，调节CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，进一步抑制Th1和Th17细胞;Tregs是维持自身免疫耐受与T细胞免疫稳定的关键因素，它在维持机体免疫稳定、预防自身免疫性疾病方面具有重要作用［3-7］。近年来 CD4+CD25+Foxp3+Tregs在allo-HSCT后GvHD免疫调节中的作用成为研究热点，本文就Tregs在GvHD免疫治疗中的研究进展做一综述。

1 Tregs的分类及与GvHD治疗的关系

1995年 Sakaguchi等［2］在小鼠外周血中发现5% ～10%的CD4+T细胞高表达IL-2受体CD25，因具有免疫抑制和免疫调节功能而被命名为Tregs。随后又发现了特异性表达于Tregs中的Foxp3，其转录因子与Tregs表面多种膜蛋白如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(glucocorticoid-induced TNF receptor，GITR)、CD22、CD103、CD44 的表达关系密切［3］。Foxp3对Tregs免疫抑制因子的分泌有重要的调控作用，因此将其作为区分Tregs和普通T细胞的特异性标志。目前对于Tregs细胞亚群的分类命名尚不统一。Tregs按其来源不同可以分为占Tregs绝大部分的胸腺来源的Tregs(tTregs)，又称为天然型 Tregs(nTregs)和外周型 Tregs(pTregs)，pTregs又称诱导型 Tregs(iTregs)［3］。

GvHD的特征是免疫系统中效应细胞和调节细胞之间的失衡，导致炎性细胞因子过度产生。HSCT前的预处理方案包括照射或化疗可引起宿主器官损伤而导致促炎细胞因子的释放。这些细胞因子刺激宿主抗原呈递细胞，将宿主抗原多肽呈递给供体移植物中的T细胞，致使T细胞将其识别为外来抗原，导致移植后T细胞活化。供体的幼稚T细胞经刺激后分化为产生细胞因子的效应T细胞，主要为CD4+T细胞的Th1或Th17类型细胞及CD8+效应细胞的Ⅰ型细胞毒性T细胞。细胞因子风暴和组织损伤引起趋化因子介导的连锁反应形成正反馈回路，致使更多的效应细胞如细胞毒性T细胞、NK细胞和巨噬细胞被募集，导致肠道、肝脏和皮肤等器官损伤。幼稚T细胞在IL-6和转化生长因子β(transfecting growth factorβ，TGF-β)作用下优先分化为效应性T细胞，从而导致Tregs数量减少。此外，IL-6能够通过激活Toll样受体来抑制nTregs的抑制功能从而导致Tregs细胞功能进一步减弱［4］。

nTregs通过接触和非接触依赖性机制介导其免疫抑制功能。接触依赖性机制涉及免疫抑制分子的表达，如CTLA-4、淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)和神经降压素-1，这些免疫抑制分子能抑制共刺激标志物导致T细胞增殖减少。非接触依赖性的免疫调节机制涉及多种细胞因子的分泌，如 IL-10、TGF 和 IL-35［5］，该研究证实供体移植物中Tregs数量增多可以降低GvHD相关的风险，而allo-HSCT后早期nTregs降低与GvHD风险增加有关;活动期慢性GvHD患者中Tregs数量比健康志愿者明显减少，说明GvHD可能和Tregs的缺乏有关;细胞毒性T细胞除了介导GvHD，还具有移植物抗肿瘤效应(graft-versus-tumor，GvT)，因此抑制细胞毒性T细胞的活性可能会消除GvT效应。体外研究［6］已证明nTregs不抑制激活的同种异体CD8+T细胞并保留其杀伤肿瘤细胞的功能，因此nTregs细胞可以在保持GvT功能的同时减轻GvHD作用，这使其成为过继细胞输注治疗的良好选择。

研究［5］显示 T效应细胞和 Tregs比率需要在1∶1到1∶3的情况才能显著降低小鼠GvHD。新的研究［6］发现通过体内刺激或体外扩增等方法能够成功扩增nTregs，将其输注于人体用于预防和治疗GvHD，并不增加疾病复发或继发感染的风险。

2 Tregs在GvHD治疗中的可行性和安全性

采用过继Tregs细胞疗法已经证明体外扩增的T细胞在预防GvHD方面是有效的，可以安全地输注于人体内，减少GvHD的发生而且不增加复发风险。

来自波兰的学者［8］于2009年发表了第一篇用体外扩增的Tregs输注的研究报告。作者采用体外扩增的CD4+CD25+CD127－T细胞移植治疗1例急性GvHD和1例慢性GvHD，由于是首次临床试验，患者数量有限，Tregs临床应用的安全性未知。截至2019年3月底，共有17项在NIH临床试验网站上登记注册的Tregs用于GvHD的临床试验，其中有3项已经完成，4项被暂停或召回，10项正在进行中。已经完成的3项临床试验证实了Tregs输注的安全性和可行性。

2011年 Brunstein等［9］发表了脐带血扩增的Tregs临床Ⅰ期试验结果，该研究证明了23例急性GvHD患者使用脐带血Tregs的安全性和可行性。另有临床试验［10］结果表明磷酸化STAT3+CD4+T细胞的数量与供体T细胞活化和急性GvHD发生率密切相关。另外，优化IL-2剂量可克服可溶性IL-2受体对细胞因子的阻断，在同种异体移植后使Tregs存活更久，靶向抑制STAT3可以预防GvHD。最近有学者［11］首次采用异基因Tregs过继输注和低剂量IL-2联合治疗5名对常规治疗无效的慢性GvHD患者，结果显示所有患者均耐受Tregs输注，血液中循环Tregs数量增加，GvHD病情得到改善或保持稳定。

3 Tregs在GvHD防治中的体内扩增

Tregs需要 IL-2和抗原呈递细胞(dendritic cells，DCs)的T细胞受体以及共刺激信号的共同作用才能达到最佳增殖状态。研究［7］证明，在慢性GvHD小鼠模型中采用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)治疗后可增加Tregs数量，调节外周淋巴结的Th1和Th17反应，使皮肤型慢性GvHD症状减轻;Tregs对慢性GvHD的抑制作用取决于Tregs与传统T细胞比率的增加，而不是抑制功能的增强。

由于nTregs表达高水平IL-2受体α，用超低剂量IL-2就可以在体内使nTregs选择性扩增;由于是超低剂量，因此不足以刺激T效应细胞［12-13］。有学者［12］前瞻性地用超低剂量IL-2(100 000～200 000 IU/m2)治疗16名儿童GvHD患者，每周3次，从移植后第7～30天开始，持续至12周，结果显示接受超低剂量IL-2治疗的患者中无3～4级毒性反应，且经IL-2治疗6周后，患者Tregs的平均比例从治疗前的4．8%增加到11．1%，所有接受IL-2治疗的患者均未发生2～4级急性GvHD，而对照组发生率则为12%;此外，接受IL-2治疗的患者病毒感染的发生率(15%)也低于对照组(63%)。以上研究结果显示体内Tregs扩增可产生足够的nTregs，从而减少GvHD的发生，与T细胞体外扩增相比，相对便宜，不需要大量的细胞分选和细胞培养。另有研究［13］证实低剂量IL-2治疗难治性慢性GvHD也有效。35例由于应用激素导致的难治性慢性GvHD患者每天给予1×106IU/m2的IL-2治疗12周后，Tregs水平比治疗前增加了5倍，而传统T细胞或CD8+T细胞无显著变化。

最近一项利用对溴代吗啡和外末端蛋白(bromomorphine and extrinsic protein，BET)为靶点来限制促炎细胞因子的BET抑制剂(BETi)的研究［14］结果表明，在Allo-HSCT后联合使用BETi与Tregs可以改善GvHD症状;采用类肿瘤坏死因子配体1a和免疫球蛋白复合体(TL1a-Ig)和低剂量IL-2分别靶向TNF Rsf25和CD25，可以显著扩增并选择性激活Tregs，使其功能明显增强;移植后的受体小鼠经过TL1a-Ig、IL-2联合 EP11313(一种 BETi)治疗 7 d后，肿瘤坏死因子和干扰素的水平明显降低。此外用体内扩增供体Tregs对Balb/c小鼠进行MHC不匹配的B6小鼠异基因骨髓移植，结果显示在接受扩增Tregs联合EP11313治疗的异基因骨髓移植小鼠中，移植后早期脾脏和淋巴结中的CD4/CD8比值改善，T效应细胞减少，Tregs水平升高，GvHD症状减轻，皮肤和眼部的受累症状减轻。

另有研究［15］针对TNFRSF25和CD25两个受体对HSCT后的Balb/c小鼠的Tregs进行体内扩增治疗GvHD，与HSCT同时使用环磷酰胺和体内扩增Tregs移植的小鼠相比，这两种方案都可以使GvHD症状减轻，长期生存率提高，在HSCT 3个月后，接受环磷酰胺和Tregs体内扩增治疗的小鼠均表现出对同种异体皮肤移植的耐受性和相关的免疫功能恢复，但是仅给予Tregs体内扩增的小鼠在HSCT后早期体重降低较少，胸腺损伤更小，因此，体内扩增Tregs可以作为预防GvHD的一个很有价值的治疗方案。

4 Tregs在GvHD防治中的体外扩增

与成人T细胞相比，脐带血中T细胞含有较高比例的CD4+CD25+亚群，而且大多数是幼稚T细胞，经刺激后不易成为效应性T细胞。因此，脐带血是Tregs体外扩增的重要来源。Brunstein等［9］首次在成人双脐带血移植中使用脐血扩增的Tregs进行临床试验，从部分HLA匹配的脐血中分离的Tregs经抗CD3及抗CD28单抗刺激扩增后输注;在23例接受剂量为30×105个/kg Tregs输注的患者中，17(74%)例Tregs增加，中位数扩张211倍;所有扩增后的Tregs在体外均具有抑制作用，中位抑制率为86%，且未发现输液毒性;脐带血Tregs在移植后14 d内均可以检测到，其中大部分受试者Tregs数的峰值出现在移植后第2天。与108例对照组患者相比，Tregs组2～4级急性GvHD发生率(43%vs 61%)降低，但2组在复发、感染和早期死亡率方面差异无统计学意义。

另有研究［16］报告了5例接受脐带血Tregs移植的患者(2例双脐带血移植;3例外周血匹配的非相关供体移植)在供体移植前1天接受了脐带血Tregs(剂量1×106个/kg)输注，结果显示所有患者均无输液反应。患者脐带血移植后细胞植入成活的中位数为13(8～17)d。移植后患者血浆中的IL-10水平在第7天和第21天出现双峰。所有患者的血浆IL-2水平显著下降。所有患者均发生过2级以上的急性GvHD。移植后第7天检测慢性GvHD生物标志物(Reg3a和Elafin)时未观察到增加。

对Ⅰ型调节性T细胞(TR1)在急性GvHD小鼠模型中作用的研究［17］发现，用维生素D3和地塞米松诱导小鼠CD4+T细胞体外分化为TR1，并在骨髓移植当天注入供者源性TR1，与GvHD组比较，TR1输注组小鼠体重减轻幅度减小，生存率提高2倍，组织病理学分级降低。

有学者［18］建立了一个产品生产质量规范兼容扩增方案，可提高临床试验的Tregs的数量和纯度。该方案采用6个临床级操作程序分离Tregs后，用大剂量IL-2、抗CD3/抗CD28 T细胞受体刺激和雷帕霉素扩增19 d，平均扩增 8．5(6．3 ～13．7)倍。培养期间Foxp3的表达稳定，而CD127的表达降低;体外抑制试验也表明扩增后的Tregs通过常规T细胞(Tcons)对白血病细胞具有较强的抑制作用。该方案为大剂量Tregs/Tcons临床治疗高危/复发/难治性白血病患者提供了良好的扩增方法。

另有研究［19］用阿扎胞苷/地西他滨体外处理人外周血T细胞，分析HLA-G表达及其体外抑制特性，结果发现低甲基化药物(HA)治疗通过HLA-G近端启动子的低甲基化诱导T细胞上HLA-G的重新表达。HA诱导后的CD4+HLA-G+T细胞表现为Foxp3阴性，在体外具有很强的抑制性细胞的功能。该细胞在TNF存在下可保持其抑制功能，并在阿扎胞苷预处理后将低甲基化维持至少2 d，因此体外通过药物低甲基化可产生表达HLA-G的一个Tregs亚群，纯化后可用于过继免疫治疗。

体外Tregs的扩增中一个很重要的问题是细胞的纯度。使用免疫磁珠分离Tregs有可能被T效应细胞污染［20］。使用雷帕霉素可以减少T效应细胞的不良扩增和增加扩增的Tregs的稳定性。经过修改体外扩增程序后能够产生高达100×106个/kg的脐带血 Tregs数量［21］。

5 Tregs研究新进展

有学者［22］已经成功地从切除的儿童胸腺中分离出Tregs。与pTregs相比，这些 nTregs有以下优点:数量多，单个胸腺中Tregs的产量超过了平均成人循环血中的Tregs数量;Tregs扩增后比血源性的Tregs有更强的抑制功能和稳定性。此外，有关Tregs细胞治疗的另一个进展是开发了用于临床的Tregs细胞分选机。使用此机器可获得不同的Tregs亚组:CD4+CD25+CD127－CD45RA+的幼稚 T细胞、在炎症条件下表现出更稳定和功能更强的CD4+CD25+CD127－CD39hiTregs［23］、CD4+CD25+CD127－CD226－Tigit+的不稳定型 Tregs［24］。这些结果为Tregs的下一步临床研究提供了细胞来源和分离方法。

6 未来的研究方向

Tregs的发现加深了人们对GvHD免疫机制的了解，推动了其免疫治疗的进程。越来越多的研究证明，即使在应用大剂量药物的情况下，Tregs也有良好的临床耐受性。目前临床中常规应用Tregs的主要障碍在于它在循环中的数量低，需要扩增，扩增后的细胞不稳定以及体外扩增后由于细胞纯度问题对促炎微环境的抑制。应用体外扩增技术生产足够数量的Tregs需要专业技术以及昂贵的细胞分选和培养方法，进一步生产出“成品”Tregs尚需时日。目前体内nTregs扩增具有成本低、效益更高、更容易实施的优点，比体外Tregs扩增更有利于广泛的临床应用。

总之，对于GvHD，Tregs是一种很有前途的细胞免疫治疗方法。临床前期试验和初步临床数据表明Tregs对急性和慢性GvHD有效。未来对Tregs进一步的研究将会集中在以下几个方面:细胞来源、分离方法、输注剂量、输注时机、最佳免疫抑制方案和输注后的细胞归宿。