清热散结胶囊指纹图谱技术研究

刘厚权 张俊英 毛艳艳 毛艳峰 胡吉忠 杨涛

（江西普正制药有限公司 吉安331409）

清热散结胶囊是采用千里光单味药材生产的中成药，具有消炎解毒、散结止痛的作用，可用于急性结膜炎、急性咽喉炎、急性菌痢、上呼吸道炎、急性支气管炎、急性扁桃腺炎、淋巴结炎、皮炎湿疹、中耳炎等的治疗[1]。千里光药材收载于2015年版《中国药典》，其主要以金丝桃苷作为指标性成分来控制质量[2]。据文献报道，千里光药材中含有槲皮素、木犀草苷、芦丁、千里光碱、阿多尼弗林碱等成分[3]。清热散结胶囊以绿原酸为主要指标性成分来进行质量控制，目前的质量标准难以真实反应产品内在品质，因此本研究选择千里光中多种有效成分如金丝桃苷、槲皮素、绿原酸、木犀草素等[4～5]进行定性分析，并建立高效液相色谱指纹图谱，以多种有效成分的含量来评价产品的品质，更好的控制产品的质量，保障产品的临床疗效和用药安全。现报道如下：

1 仪器、试药与样品信息

1.1 仪器 AB104-N万分之一天平（梅特勒-托利多）；AUW2200十万分之一天平（SHIMADZU）；KQ3200超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Mili-Q超纯水仪（Milipore公司）；Waters2695高效液相色谱仪（Waters公司）。

1.2 试剂 甲醇：分析纯，上海振兴化工一厂；乙腈：色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司；磷酸：分析纯，广东光华科技股份有限公司。

1.3 对照品 绿原酸：110753-201415，中国食品药品检定研究院；金丝桃苷：111521-201507，中国食品药品检定研究院；槲皮素：100081-201408，中国食品药品检定研究院；木犀草苷：111720-201408，中国食品药品检定研究院。

1.4 药材 千里光药材购置于樟树药材市场，经江西普正制药有限公司吴永忠研究员鉴定为千里光（Senecio scandens Buch.-Ham）。

1.5 清热散结胶囊样品 江西普正制药有限公司生产的清热散结胶囊产品，批号有：121101、121102、121103、121104、121201、121202、130702、130703。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、金丝桃苷、槲皮素、木犀草苷对照品2.5 mg，加入75%甲醇50 ml充分溶解、稍振摇，作为对照品溶液。

2.1.2 清热散结胶囊供试品溶液制备 取清热散结胶囊内容物1.0 g，精密称定，充分研磨成细粉后放置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，称重，超声处理（功率 250 W，频率 50 kHz）30 min，取出，然后冷却至室温，用75%甲醇弥补足损失的重量，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.1.3 药材供试品溶液制备 取千里光药材1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 ml，称定重量，于75～85℃水浴加热回流1 h，取出，放冷，用75%甲醇弥补损失的重量，滤过，取滤液作为千里光药材对照品溶液。

2.1.4 千里光浸膏样品溶液制备 按照清热散结胶囊生产制备工艺，取中间产品浸膏粉0.4 g，精密称定，加入75%甲醇20 ml，称量，超声（功率250 W，频率50 kHz）处理30 min，取出，冷却至室温，用75%甲醇弥补足损失的重量，滤过，取滤液作为千里光浸膏粉对照品溶液。

2.2 高效液相色谱条件 仪器：Waters高效液相色谱仪（Waters2695分离单元，Waters2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站）；色谱柱：ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长 0 min∶220 nm，15 min∶280 nm，30 min∶325 nm，40 min∶360 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；流动相：乙腈为流动相A，0.05%磷酸水溶液为流动相B，按表1梯度洗脱。

表1 梯度洗脱体积比浓度配置

2.3 系统适应性 分别取各对照品溶液、清热散结胶囊样品溶液、药材的供试品溶液、千里光浸膏溶液及空白溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪中，按照高相液相色谱法进样测定分析。通过对比各样品的高效液相色谱图谱，清热散结胶囊供试品溶液中只检出绿原酸，而千里光药材和浸膏中可以检出金丝桃苷和绿原酸，两者均未能检出槲皮素、木犀草苷、木犀草素。见图1～图8。

图1 清热散结胶囊样品色谱图谱

图2 千里光药材

图3 千里光浸膏样品色谱图

图4 金丝桃苷对照品色谱图

图5 绿原酸对照品色谱图

图6 槲皮素对照品色谱图

图7 木犀草苷和木犀草素混合对照品色谱图

图8 空白对照色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取批号121104清热散结胶囊样品，根据上述样品溶液制备方法制备清热散结胶囊样品溶液，连续进样5次，将5次进样供试品样品HPLC图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件，进行相似度评价。结果显示相似度在0.95以上，说明仪器精密度良好。见表2。

表2 连续五次进样相似度分析

2.4.2 重现性试验 取批号130702的清热散结胶囊样品，根据上述样品溶液制备方法制备清热散结胶囊样品溶液，平行制备溶液6份，连续进样，将6份进样供试品样品HPLC图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》相似度软件，进行相似度评价。结果显示相似度在0.95以上，说明本方法重现性良好。见表3。

表3 平行样品相似度分析

2.4.3 稳定性试验 取批号121202的清热散结胶囊样品，根据上述样品溶液制备方法制备清热散结胶囊样品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 后进样。将6次进样供试品样品HPLC图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》相似度软件，进行相似度评价。结果显示相似度在0.95以上，说明供试品溶液在24 h内稳定。见表4。

表4 不同时间段相似度分析

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱的建立 取8批清热散结胶囊样品，根据上述样品溶液制备方法制备清热散结胶囊样品溶液，分别精密吸取供试品溶液5 μl，分别注入液相色谱仪，获得各批次清热散结胶囊的HPLC图谱。将8批清热散结胶囊图谱作为清热散结胶囊参照指纹图谱。其中共有12个特征共有峰，12个特征共有峰的平均保留时间如表5所示，图谱总长度为60 min。对比绿原酸对照品图谱我们得出峰7为绿原酸。见图9和表5。

图9 清热散结胶囊指纹图谱

表5 特征共有峰保留时间

2.5.2 相似度评价 将8批清热散结胶囊色谱数据和清热散结胶囊对照指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》相似度软件进行相似度评价。结果显示不同批次清热散结胶囊指纹图谱的相似度大于0.9，说明各批次样品的化学成分一致性较好，说明江西普正制药有限公司生产的清热散结胶囊产品批间稳定性较好，产品质量均一性较好。见表6和图10。

表6 不同批次清热散结胶囊指纹图谱相似度计算结果

图10 不同批次清热散结胶囊指纹图谱相似度评价

3 讨论

本研究建立的清热散结胶囊的高效液相指纹图谱共有12个特征峰，可以表征产品的有效成分，该方法稳定可靠，重复性较好，可以作为清热散结胶囊的质量控制方法。本研究结果表明，不同生产批次的清热散结胶囊指纹图谱相似度在0.9以上，批次间相似度较好，说明江西普正制药有限公司生产的清热散结胶囊批间均一性较好，产品临床疗效稳定，安全性较好。本研究发现，清热散结胶囊样品中只检出绿原酸，而千里光药材和浸膏中可以检出金丝桃苷和绿原酸，但未能检出槲皮素、木犀草苷、木犀草素，这其中的原因还需要进一步研究。