白藜芦醇调控长链非编码RNA MALAT1抗动脉粥样硬化

2019-01-04贾雪凌范玉华赵宝山陈红阳蒋雅楠宋印利

中国药理学通报 2019年1期

贾雪凌，范玉华，潘昱，方坤，赵宝山，王麟，陈红阳，蒋雅楠，宋印利

[哈尔滨医科大学(大庆)1. 基础医学院病理学与病理生理学教研室、2. 药学院生物技术制药教研室，黑龙江大庆 163319]

白藜芦醇(resveratrol, Rev)是一类天然多酚化合物，主要存在于葡萄、红酒和传统药材虎杖的根中。研究发现，Rev具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等作用[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是引发心血管疾病的主要原因，Rev具有良好的抗AS作用。众所周知，Rev可以多靶点改善内皮功能障碍，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，减少巨噬细胞浸润和泡沫细胞的形成，以及减少脂质堆积等，发挥预防和治疗AS的作用[1]。

AS是一类以炎性浸润和脂质积聚为特征的慢性炎症性疾病，其中，动脉壁中持续的巨噬细胞积聚是发病机制的基础。人们发现，在患者动脉斑块中存在着大量的巨噬细胞，这些巨噬细胞是由内膜中单核细胞分化而来的，通过分泌促炎细胞因子(如IL-6、IL-1β、TNF-α)，吸收胆固醇、脂质形成泡沫细胞，以及引发细胞凋亡等，促进AS斑块的形成、发展和破裂[2-3]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)是一类由RNA聚合酶II转录，长度超过200个核苷酸，且缺乏蛋白编码能力的内源性非编码RNA。过去，人们认为lncRNAs是转录过程中的“噪音”，近年来发现它在心血管疾病的发生和发展中具有重要的意义。人类肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript1, MALAT1)是目前研究最为深入的一种高度丰富和保守的lncRNAs，其长度约为8 000 nt，定位于染色体11q13[4]。据报道，MALAT1参与多种心血管疾病的病理生理过程[5-6]。Han等[7]发现，MALAT1在糖尿病AS大鼠的巨噬细胞中表达增高，提示MALAT1与AS密切相关。尽管有研究表明，氧化型低密度脂蛋白可通过促进MALAT1转录，进而增强巨噬细胞中的脂质摄取[8]，但MALAT1在AS中的确切作用机制仍尚不明确，有待进一步研究。由于Rev的潜在抗动脉硬化作用，以及MALAT1参与糖尿病AS发生发展过程，因此，本研究旨在探讨Rev调控MALAT1发挥抗AS作用的机制，并阐明MALAT1在AS中的潜在作用，为指导临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8周龄ApoE-/-小鼠，♂，体质量(27±3)g，购自南京君科生物工程有限公司[SCXK(苏)2016-0010]。所用动物饲养在标准实验动物房内，温度(23±1) ℃，湿度55%～60%，可自由摄食饮水。ApoE-/-小鼠12只，随机分为ApoE-/-高脂饮食(high fat diet, HFD)组和ApoE-/-高脂饮食加Rev(10 mg·kg-1)组，每组6只，高脂组和Rev组分别给予高脂饮食饲养16周。高脂饲料含78.85%基础饲料、0.15%胆固醇、21%脂肪。16周后，每组取6只小鼠，异戊烷吸入麻醉下，取血管及心脏，-80 ℃或4%多聚甲醛固定保存备用。

1.1.2药物与试剂 Rev购自美国Sigma公司，称取Rev粉末，溶于DMSO中，配制成终浓度为100 mmol·L-1的Rev储存液，4 ℃避光保存备用；脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、游离胆固醇(free cholesterol, FC)、巯基乙酸培养基(thioglycollate medium)，均购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒、引物购自TaKaRa公司； MALAT1干扰RNA(siMALAT1-1、siMALAT1-2、siMALAT1-3)及阴性对照(siNC)由上海吉玛制药有限公司合成。

1.1.3仪器 Eppendorf 5430R高速离心机、Eppendorf-flexlid梯度PCR仪(德国艾本德公司)；NanDrop One核算蛋白定量仪(美国赛默飞世尔公司)；Sunrisere Tecan光吸收酶标仪(奥地利帝肯公司)；H-7650日立透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.2方法

1.2.1巨噬细胞的提取与分离正常C57BL6小鼠腹腔注射3%巯基乙酸肉汤，4 d后通过腹膜灌洗法获得腹腔巨噬细胞，将细胞接种于含有10%胎牛血清，含100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1链霉素的DMEM培养液的培养皿中。4 h后，将非贴壁细胞洗去，并将腹腔巨噬细胞孵育在含有10%胎牛血清和20% L929上清的DMEM培养液中2 d，每天更换新鲜培养液。

1.2.2HE染色法将不同处理组心脏取出，4%多聚甲醛固定过夜，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片。主动脉窦的石蜡切片苏木素染色5 min，自来水冲洗1 min，盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗1 min，伊红30 s，自来水冲洗1 min，80%乙醇30 s，90%乙醇30 s，100%乙醇3 min，二甲苯10 min，中性树脂封片。

1.2.3实时定量PCR检测细胞通过药物或转染试剂处理后，用TRIzol法提取细胞总RNA，取1μg总RNA逆转录成cDNA，产物分别进行MALAT1、IL-6、IL-1β、TNF-α及GAPDH的扩增，采用PCR仪运行此实验。反应循环为40个。MALAT1引物序列为上游： 5′-CCCCAGCTTTTCCAGAATCC-3′，下游：5′-GCATCAAGGTGAGGGGTGAA-3′；IL-6引物序列为上游：5′-GGCGGATCGGATGTTGTGAT-3′，下游：5′-GGACCCCAGACAATCGGTTG-3′；IL-1β引物序列为上游：5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′，下游5′-ATCTTTTGGGGTCCG TCAACT-3′；TNF-α引物序列为上游：5′-GGAACACGTCGTGGGATAATG-3′，下游5′-GGCAGACTTTGGATGCTTCTT-3′；GAPDH引物序列为上游：5′-AGTGGCAAAGTGGAGATT-3′，下游5′-GTGGAGTCATACTGGAACA-3′。

1.2.4电镜观察取模型组斑块组织及给药处理组斑块处，用2.5%戊二醛固定30 min后，制成超薄切片，在1万倍下采取20个视野，随机选取7处。电子显微镜下观察斑块中泡沫细胞形成及数量。

2 结果

2.1Rev减少泡沫细胞缩小动脉斑块Fig 1A结果显示，连续给予Rev能够明显降低动脉血管壁及主动脉弓斑块的形成。HE染色结果表明，给予Rev 16周能够明显降低主动脉根部动脉斑块面积(Fig 1B)。进一步采用电镜观察发现，Rev处理组能够明显降低泡沫细胞的形成(Fig 1C)。

2.2Rev剂量依赖性地上调MALAT1的表达水平我们进一步研究Rev是否通过调控MALAT1，进而发挥抗AS作用。Fig 2A结果表明，Rev(1、3、5 μmol·L-1)处理腹腔巨噬细胞24h，能够剂量依赖性地上调MALAT1的表达。为了进一步验证Rev对MALAT1表达的作用，采用real time PCR检测Rev(3 μmol·L-1)分别处理12、24、48 h后MALAT1的表达。Fig 2B结果显示，Rev处理12 h对MALAT1 mRNA表达影响不明显，处理24 h MALAT1 mRNA表达明显增加，处理48 h MALAT1 mRNA无法继续上调。可见，Rev对MALAT1调控作用不是时间依赖性，提示Rev可能部分通过调控MALAT1表达发挥抗AS作用。

为了进一步验证MALAT1在AS中的作用，我们采用real time PCR检测动脉斑块中MALAT1表达水平。结果显示，给予HFD的ApoE-/-小鼠动脉斑块中MALAT1 mRNA水平明显下调。此外，Rev明显逆转高脂饮食引起的ApoE-/-小鼠斑块中MALAT1 mRNA的下调(Fig 2C)。可见，MALAT1参与AS发生、发展进程。

2.3Rev抑制IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表达正常小鼠的腹腔巨噬细胞给予Rev刺激24 h后，100 μg·L-1LPS刺激3 h，采用real time PCR检测Rev对炎症因子表达的影响。Tab 1结果表明，LPS能够显著刺激IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达，而Rev能明显降低IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达。

Fig 1 Rev attenuatedformation of atherosclerosis plaques in ApoE-/- mice

A:Representative aorta preparations of the total aorta treated with Rev(10 mg·kg-1) or without Rev in ApoE-/-mice fed a HFD diet for 16 weeks; B: Representative histological analysis of cross-sections of the aortic sinus(scale bar: 400 μm); C:Macrophage-derived foam cells were filled with abundant lipid droplets.

Tab 1 Effects of Rev on mRNA levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in n=6)

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsLPS

2.4下调MALAT1促进IL-6、TNF-αmRNA的表达巨噬细胞给予siMALAT1(1-3)或阴性对照(NC)处理36 h后，实时定量PCR检测不同处理组对MALAT1表达的影响。Fig 3A结果表明，siMALAT1-3能够明显降低MALAT1 mRNA表达。继续选用siMALAT1-3孵育细胞36 h后，给予100 μg·L-1LPS刺激3h，实时定量PCR检测siMALAT1-3对炎症因子表达的影响。Fig 3B结果表明，siMALAT1-3孵育36 h能明显促进IL-6、TNF-α mRNA表达。

2.5FC刺激巨噬细胞MALAT1表达下调FC(10 mg·L-1)刺激巨噬细胞3、6、12 h，Fig 4结果表明，FC刺激3、6h能够明显降低MALAT1 mRNA表达。提示Rev可能通过调控胆固醇，进而影响MALAT1表达，从而调控炎症因子IL-6和TNF-α表达，发挥抗AS作用。

3 讨论

心血管疾病是导致人类高死亡率的主要病因。长期以来，天然产品广泛用于预防和治疗包括心血管疾病在内的慢性疾病。Rev作为研究最多的膳食天然产品之一，已显示出对多种疾病具有保护作用。然而，Rev在AS中的保护作用及潜在机制尚未完全清楚。最近研究表明，Rev可以减少三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide,TMAO)诱导的AS鼠的主动脉斑块面积[9]。此外，Chang等[10]发现，HFD诱导的AS鼠中，每天给予高剂量Rev(25mg·kg-1)8周，可以明显降低低密度脂蛋白胆固醇和IL-6水平。

本研究结果表明，每天给予Rev(10mg·kg-1)16周，能够明显降低ApoE-/-小鼠主动脉弓部及根部斑块的面积和泡沫细胞的数量。Arslan等[11]发现，MALAT1在AS斑块中表达减少，这与我们的结果是一致的。在本研究中，腹腔巨噬细胞给予Rev后，发现MALAT1的表达量升高，且这种升高具有剂量依赖性，通过进一步验证MALAT1在AS中的作用，我们发现Rev明显逆转高脂饮食引起的ApoE-/-小鼠斑块中MALAT1的下调。进一步研究表明，Rev能够抑制炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。Tang等[12]发现，MALAT1具有抗炎作用，保护内皮细胞免受氧化型低密度脂蛋白损伤。Zhao等[13]的研究表明，MALAT1参与调节先天免疫和炎症反应，敲低MALAT1会增加LPS诱导的TNF-α和IL-6的表达。因此，我们假设MALAT1可能通过调控炎症来发挥抗AS作用。与我们预期相一致的是，在腹腔巨噬细胞中敲降MALAT1后，qPCR结果显示能够明显增加LPS诱导的炎症因子IL-6和TNF-α的表达。虽然本研究并没有发现敲低MALAT1对IL-1β有明显的抑制作用，但是Rev对MALAT1的调控，以及MALAT1对炎症因子的调控作用已明确，且实验结果表明，Rev对炎症因子IL-6和TNF-α同样具有调控作用。因此，我们推断Rev抗AS作用部分通过调控MALAT1。

Fig 2 Effects of Rev on expression of lncRNA

A:Rev could reduce the level of MALAT1 in a dose-dependent manner; B: Rev could increase expression of MALAT1 at the 24 h incubation; C: MALAT1 decreased in HFD diet in ApoE-/-mice, while Rev could elevate the level of MALAT1 in HFD diet in ApoE-/-mice.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05vsHFD group.

Fig 3 Effects of MALAT1 on mRNA expressionof IL-6 and TNF-α in

A:siMALAT1-3 could significantly decrease the level of MALAT1; B:The mRNA levels of IL-6 and TNF-α were dominantly elevated by treatment with siMALAT1-3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

胆固醇是AS病变中的主要成分，过多的胆固醇可使巨噬细胞形成泡沫细胞，泡沫细胞的大量积聚可形成脂质条纹和斑块。因此，巨噬细胞中胆固醇的平衡流动是避免脂质积累和控制AS发展所必需的。Voloshyna等[14]研究表明，Rev可通过上调胆固醇转运蛋白(ABCA1、ABCG1、SR-BI)的表达，减少THP-1巨噬细胞中的游离胆固醇和胆固醇酯含量。此外，Rev也可通过降低血浆极低密度脂蛋白水平，促进巨噬细胞的胆固醇流出[15]。本实验，FC刺激腹腔巨噬细胞后，发现MALAT1的表达明显下降。本研究表明，Rev能够抑制AS发生发展，且Rev可能通过调控MALAT1及胆固醇发挥抗AS的作用。但Rev是通过直接还是间接调控MALAT1，发挥抗AS作用并未证明，且未深入探讨MALAT1下游调控的潜在靶点。因此，我们后续实验会全面地阐明MALAT1的作用机制，以及Rev对MALAT1的调控机制。