碳纳米材料在肿瘤药物递送系统的研究进展

李浩贤，林华庆，陈靖文，王利媛

(广东药科大学药学院广东省药物新剂型重点实验室，广州 510006)

肿瘤是人类死亡的主要原因之一，对肿瘤的防治是目前重要的公共卫生问题。之所以传统的载药系统对肿瘤的治愈率低，一方面是因为传统的载药系统靶向性不强，在体内没有达到一定的特异性分布，导致机体自身的正常细胞受到严重损害，尤其对造血系统与免疫系统产生较严重不良反应，影响肿瘤治疗效果[1-2]；另一方面是因为传统的载药系统难以克服肿瘤组织弱酸性、蛋白质和酶表达高，温度梯度异常，核内体和溶酶体有不同的酸性条件等独特的微环境[3]，停留时间短，药物不能被有效地递送到肿瘤细胞的内部，导致药物有效率不高。如何能把药物安全高效地运送到肿瘤细胞并发挥作用是目前肿瘤治疗亟待解决的难题，因此肿瘤的治疗需要新的载药系统。近年来，研究者逐渐把研究重点转移到碳纳米材料领域，并取得较大进展。

碳纳米材料是一种具有广阔前景的新兴治疗工具与载药材料。碳纳米材料是指由碳元素构成，至少一个三维尺寸为1～100 nm的天然或人工材料。由于具有sp2或sp3杂化轨道，每种碳纳米材料具有独特的结构与功能[4]。碳纳米材料难溶于水溶液，生物亲和性不高，需根据运载目的通过共价键和非共价键表面修饰的方法进行改善。前者主要利用碳纳米材料表面的缺陷(主要是含氧官能团)及芳香环结构进行修饰，但受可用化学反应类型及可用于修饰的官能团的数量限制，会破坏碳纳米材料的结构。非共价键修饰包括π-π相互作用、疏水相互作用及氢键相互作用等超分子相互作用力，可不受上述限制，不仅能保持碳纳米材料的结构，还可以增强碳纳米材料的分散性与生物相容性并赋予其新的物理化学特性[5]。经过修饰的碳纳米材料作为药物载体，具有比表面积大、光学性质独特、生物相容性好、毒性低的特点，能够利用载体的屏蔽作用保护药物[2]，增强药物的靶向性、溶解性与体内外稳定性，而且由于具有高渗透长滞留效应[6]，容易被肿瘤细胞摄取，能长时间聚集于肿瘤组织中，延长作用时效。碳纳米材料主要包括准零维量子性结构[7]的量子点、一维量子性结构[8]的碳纳米管、二维量子性结构[9]的氧化石墨烯和三维量子性结构[10]的介孔碳纳米球等，本文着重对以上碳纳米材料用于肿瘤药物的递送与安全的研究进展进行综述。

1 量子点(quantum dots,QDs)

QDs是指颗粒半径小于其激子波尔半径的纳米晶粒，三维空间尺寸都小于100 nm，它们的粒子尺寸在2～10 nm之间[11-12]。QDs主要有碳量子点与石墨烯量子点两种类型[13]，其光致发光以及光稳定性有利于监测体内药物递送以及肿瘤诊断，常用于靶向载药、生物成像、免疫分析与检测和生物分子标记等领域[14]。当前QDs在药物递送中的应用集中在两个领域：作为药物的载体以及用于标记、追踪药物递送[15]。

1.1 碳量子点(carbon quantum dots,CQDs)

2004年科学家在单壁碳纳米管纯化中发现了CQDs[16]。与其他量子点相比，CQDs具有高化学稳定性、低毒性、能吸收宽带光、光致发光特性优异等性质[17]。CQDs表面富含羧基，因此有较好的水溶性以及生物相容性，且能低成本大规模合成[13]。此外，CQDs适合表面钝化，能被多种聚合物、无机、有机、生物材料进行化学修饰[18]。Gong等[19]研制了磷和氮双掺杂空心CQDs。小粒径，中空结构和具有丰富氮基团的特点赋予了CQDs荧光特性，可作为体内外药物监测。同时，作为多柔比星(doxorubicin，DOX)的载体，能增强DOX的核内递送和肿瘤积聚，有效抑制肿瘤生长。经过修饰后的CQDs不仅能够进行治疗检测，而且能够实现肿瘤细胞外微环境触发药物靶向释放的作用。Feng等[20]利用RGD肽修饰的CQDs装载顺铂IV，并在表面通过苯甲酰亚胺键与甲氧基聚乙二醇(mPEG)连接，得到pH/氧化还原双响应CQDs载体。在肿瘤细胞外环境pH(6.5～6.8)中，苯甲酰亚胺键断裂，mPEG脱落，RGD肽得以暴露，后者靶向作用于肿瘤细胞的整合素，从而促进了肿瘤细胞对该复合物的内化作用，顺铂IV前药在肿瘤细胞中被还原成顺铂产生治疗作用。

1.2 石墨烯量子点(graphene quantum dots,GQDs)

GQDs是将二维结构的石墨烯转换成准零维结构的量子点，保持了石墨烯固有的层状结构基元，横向尺寸较小，外围羧基丰富，与生物体系更加相容[21-22]。GQDs具有类似CQDs的性能，同时又避免了CQDs在尺寸效应和准球形结构方面的限制[14]。Wang等[23]提出，GQDs能在没有任何修饰的情况下具有良好的药物递送能力。但是GQDs仍存在水溶性差、量子产率低的问题，需要通过合理的修饰来提高GQDs各方面的性能[14]。Wo等[24]在羧基化的GQDs上结合磁性纳米球，装载DOX。GQDs在体系中起到光动力学和药物递送的作用，GQDs在近红外激光照射下产生光热效应，有效地破坏肿瘤细胞。在磁性纳米球作用下，起到磁场介导的机械刺激，光热损伤，光动力毒性和化疗的协同作用，可同时多方摧毁肿瘤细胞。GQDs作为纳米载体，由于在实体瘤中存在滞留效应，延长其装载药物的细胞毒效应，更好地杀死肿瘤细胞。Khodadadei等[25]在氮掺杂GQDs(N-GQDs)上装载甲氨蝶呤(MTX)，该复合物进入肿瘤细胞和被排出的速度均比游离MTX缓慢，因此其作用时间更长且对肿瘤细胞有更强的细胞毒性。

Chong等[26]发现GQD和GQD-PEG在细胞水平上均具有良好的生物相容性。HeLa细胞和A549细胞在160 μg/mL GQD-PEG作用24 h后，细胞有95%以上存活。GQD质量浓度高达640 μg/mL时，细胞存活率约为85%，GQD组的LDH释放和ROS水平与对照组相当，无明显的细胞毒性。每隔1天给小鼠注射GQD-PEG 20 mg/kg，14 d后各组小鼠均存活，且脏器外观与对照组无明显差异，表明GQD体积小、氧含量高，在体外和体内均无明显毒性，可通过肾脏迅速代谢，并保留在肿瘤中。

2 碳纳米管(carbon nanotubes,CNTs)

CNTs一般分为两种类别：由单圆柱石墨烯组成的单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotube,SWCNTs)以及由多层石墨烯片组成的多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)[27]。CNTs的圆柱状结构与细胞多点接触，有利于携带药物进行跨膜渗透，并有效促进药物穿过血-脑脊液屏障。与脂质体等传统给药载体相比，其超高的比表面积大大提高了载药量，能携带大量不同分子的和具有易被靶细胞捕获的结构的抗肿瘤药物，能通过内吞介导机制或内吞独立机制(膜融合，扩散或直接孔隙运输)进入细胞，避免被细胞泵排出[28-30]。此外，CNTs具有较强的吸收光强以及光致发光特性，能在近红外光照射下产生光热效应，能够与其携载的药物共同作用于肿瘤，增强破坏肿瘤细胞的能力。CNTs已被作为多种抗肿瘤药物的载体进行大量研究，常装载顺铂、卡铂等铂类药物，多柔比星、表柔比星等蒽环类药物，紫杉醇等其他药物[31]，进行卵巢癌、肝癌、肺癌等肿瘤细胞的研究。

但CNTs对细胞没有亲和力且难溶于水溶液，易聚集在细胞和组织中，产生强毒性，必须对CNTs进行羧基化、氨基化或用壳聚糖等高分子聚合物进行修饰后，增强其分散性与肿瘤靶向性，才能搭载如药物分子、质粒、RNA、蛋白质等活性因子靶向作用于肿瘤细胞[32-33]。Yu等[34]在一项研究中用壳聚糖与透明质酸(hyaluronicacid，HA)修饰的SWCNTs装载紫杉醇。壳聚糖增加了CNTs的生物相容性，HA增加了CNTs的肿瘤靶向性。该复合物对A549人肺肿瘤细胞系具有高毒性，对正常细胞表现出低毒性，对于肺癌的治疗有较强的选择性。此外，由于CNTs管内与管外均能载药，且管内载药具有易于控制药物释放以及保护药物到达靶点的优势，但常规的CNTs内径较小，大大地限制了CNTs的管内载药。孟艾等[35]制备了大内径MWCNT，载药率可达70.97%。管壁表面负载靶向分子与荧光标记分子，管内负载抗肿瘤药物，再利用长度短的同源CNTs封堵药物释放通道。药物从CNTs末端开口与侧壁空洞释放，实现药物的缓释。

与其他碳纳米材料类似，CNTs细胞毒性与其含有的金属杂质、长度、比表面积、分布状态、功能化、质量浓度以及细胞类型等因素有关。CNTs表面丰富的羧基会增加CNTs的细胞毒性，MWCNTs对HepG2细胞的杀伤作用随MWCNTs长度的减小而增加。经过修饰后毒性能明显减小，长度小于300 nm的MWCNTs经PEG修饰后具有较好的生物相容性[3]。CNTs的细胞毒性与其质量浓度有密切关系。细胞的活性随着CNTs质量浓度的增加而减小，细胞分泌乳酸脱氢酶(LDH)随着SWCNTs质量浓度增加呈上升趋势[36]。

3 氧化石墨烯(graphene oxide,GOs)

自从2004年石墨烯被发现之后[37]，石墨烯及氧化石墨烯得到了广泛的研究。GOs仍保持石墨烯的层状结构，可进行与石墨烯类似的碳骨架功能化、元素掺杂进行共价键改性。此外，由于GOs在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团，其边缘处的羧基和羰基等基团以及基底面上的环氧基和羟基能与不同的靶向物质结合，可经由各种与含氧官能团的反应进行共价键结合以及通过氢键与π-π键等进行非共价键结合而改善本身性质[38-41]，性质较石墨烯活泼，更常用于肿瘤药物的递送。

Zhang等[42]把生物靶分子奥曲肽结合在PEG修饰的GOs上，该复合物毒性低、体内稳定性好，能够实现生长抑素受体介导的肿瘤特异性靶向给药。装载DOX后，能显着改善肿瘤细胞特异性细胞摄取，而且由于具有强烈的近红外吸收能力，能进一步增强肿瘤的光热消融，实现对肿瘤细胞的联合治疗。Yang等[43]用羧甲基壳聚糖(CMC)修饰GOs，结合HA和异硫氰酸荧光素(FI)，得到GO-CMC-FI-HA复合物，用该复合物装载DOX以研究体外释放行为。结果表明，该复合物载药量高，借助HA的肿瘤靶向性将DOX输送到过度表达CD44受体的HeLa细胞中，在肿瘤细胞微环境下药物释放率明显高于pH较高的生理条件，实现DOX的可控释放。上述研究表明功能化的GOs在抗肿瘤药物靶向递送、控释以及联合治疗上具有较大的应用价值，但是目前所报道GOs所负载的药物多为小分子，对于大分子药物靶向运载的研究还有待发展。

Zheng等[44]发现GO纳米颗粒能黏附并聚集在人肝细胞膜表面，GO纳米颗粒与细胞的黏附引起细胞应激和活性氧的产生，导致细胞膜皱褶、渗出和凋亡。Chong等[26]通过比较GO与GQD的体内外毒性，发现GOs影响细胞膜完整性和产生氧化应激。14 d中每隔1天给小鼠注射与GQD-PEG同剂量的GO-PEG，发现注射GO-PEG的小鼠中有1/4在第4、5、6次给药后死亡，与注射GQD-PEG的结果截然不同。可能是由于GO-PEG中GO在体内聚集和在小鼠体内形成血栓，表现出一定的毒性。此外，GO-PEG小鼠肝和脾的重量指数大于其他指标，表明GO-PEG对小鼠肝和脾的慢性损伤是由于GO-PEG清除缓慢造成的。

4 介孔碳纳米球(mesoporous carbon nanospheres,MCNs)

MCNs是指孔径为2～50 nm的多孔碳纳米球。虽然对于MCNs的研究比其他碳纳米材料起步要晚，存在合成方法不成熟，自身存在固有疏水性等问题，限制了MCNs的应用，但由于MCNs结合了碳质与介孔结构的特点，显示出与其他碳材料和介孔材料不一样的优越性质，近10年来得到广泛研究与快速发展。

其优越性包括：(1)具有高孔体积的三维球形结构，比表面积大，有利于通过氧化作用在生物分子表面均匀生成官能团，通过π-π堆积和/或与碳质骨架的疏水相互作用高效装载疏水性抗肿瘤药物，为药物分子提供较大储存场所。相对于介孔硅材料，MCNs更适合装载疏水性药物，且载药量高于其他一维二维碳纳米材料[45]。此外，合适尺寸的MCNs较容易被肿瘤细胞吸收，能负载大量药物在血液运送，且孔结构可调，可通过调节孔径尺寸控制药物释放，且孔径一般小于10 nm，以防药物提前释放。Wang等[46]设计了一种基于PEG修饰的氧化MCNs。氧化后的MCNs有更大的孔尺寸与孔体积，有利于提高载药量。DOX分子的芳香族基团可通过π-π堆积和疏水相互作用与碳骨架的石墨烯相互作用装载在MCNs上。该复合物具有优异的亲水性与良好的生物相容性，有效地穿过肿瘤细胞膜，随后释放药物，延长DOX在血流中的循环，有效抑制肿瘤细胞的生长，在恶性肿瘤晚期也表现出明显的抗转移作用。(2)低旋转能，容易与实体肿瘤发生均匀的相互作用，从而提高体内传感信号的稳定性和灵敏度。(3)具有独特的光学特性，能掩盖药物荧光强度，可实现体内实时监测与和分析。Li等[47]在氧化的MCNs中装载DOX，并用单链DNA适配体加盖，产生实时成像引导的按需靶向药物递送系统，可高度积累在肿瘤中，通过定量门开关闸门实现了对MUC1定量反应的按需靶向药物递送。同时，能对细胞/液体MUC1肿瘤标志物进行灵敏检测，并通过“off-on”荧光实现肿瘤细胞的原位靶向成像。(4)在近红外区域中具有优异的热转换能力，已被开发为光热转换器，可用于肿瘤光热化疗[46,48]。(5)可受pH、光和温度等外界条件刺激，实现响应性与靶向性释药[49]。Zhou等[50]考察了MCNs装载DOX对pH、光以及温度的应答。结果发现，随着pH降低，DOX与MCNs之间的氢键和静电作用减弱，温度的升高降低了DOX与MCNs之间的相互作用，均增加了DOX的释放。此外，在光诱导下，介孔结构发生热膨胀，也能增加释药量。由于肿瘤微环境为弱酸性，MCNs能有较大的释药量，并能利用近红外光控制肿瘤细胞内药物的释放。磁性MCNs是如今研究的热门之一，在外加磁场作用下，复合物能够靶向聚集在肿瘤细胞上递送药物，但其入胞能力不强且外加磁场成本较高，常与其他载体材料协同使用，磁性MCNs的研究仍有较大的发展空间。

Zhao等[51]将Caco-2细胞暴露在MCNs中，发现即使MCNs质量浓度为800 μg/mL，细胞仍有80%存活。王琳召等[52]用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和培化磷脂酰乙醇胺(DSPE-mPEG2000)修饰MCNs，发现修饰前后材料在50 μg/mL质量浓度下并未表现出明显细胞毒性。表明MCNs修饰前后均具有良好的生物相容性，而修饰后的MCNs能明显减少活性氧产生，降低细胞氧化应激的发生。

5 总结与展望

各种碳纳米材料凭借其独特的性质，均在肿瘤药物的递送与治疗具有广阔的发展前景。光学上，QDs与CNTs具有光致发光与较强的吸收光强特性，在肿瘤成像与药物追踪检测更加突出，而MCNs的荧光熄灭能力，可实现体内药物实时监测与分析。载药上，与QDs和GOs相比，CNTs与MCNs分别凭借着其较大的管腔与内壁与独特的孔结构，再加以上述的封堵技术，不仅大大增加了比表面积，得到较高的载药量，而且能够实现药物的控释与缓释。生物安全性上,GQDs与MCNs生物安全性较高，修饰前后在较大质量浓度剂量下也无明显毒性且生物清除较快。而CNTs与GOs毒性相对较高，且与CNTs相比，GOs具有较低的细胞毒性[53]，均需经过合理的修饰降低毒性后，在适当剂量下进行载药。

碳纳米材料作为一种新型的肿瘤治疗工具，为肿瘤的诊断、治疗、监控提供了新型有效的手段，成为近年来研究的热点，但也存在一些备受关注的问题。

(1)安全问题与生物相容性问题。梅兴国课题组[54]提出“物理损伤是纳米毒性的根源”新学说，认为只有生物相容且生物可降解的纳米材料才可开发为药物载体。碳素材料虽然能够在一定程度上减小载体的细胞毒性，但未经修饰或修饰不完善的碳纳米材料生物相容性较差，进入体内会产生明显的细胞毒性与细胞损伤。目前对碳纳米材料的研究主要停留在分子水平、细胞水平或者整体动物水平上，对人体的长期毒性与不良反应的研究还不够深入，存在着材料对人体及体内所产生物质的相容性、体内药物动力学难以控制、剂量与给药途径等问题，且难以找到确切的证据支持[55]。因此今后还需探索更好的表面修饰方法降低材料毒性，提高材料的生物降解性与生物相容性，更安全有效地发挥作用。另外，还需要一系列国际性的监管标准与可靠的方法评价碳纳米材料载药的安全性。

(2)放大生产。碳纳米材料在载药方面的研究报道大部分都仅局限于实验室研究，缺乏大规模生产所需要的设备、成本以及质量控制方面的研究[56]。在工艺放大过程中，碳纳米载药材料的工艺控制难且重现性差，难以用传统和简单的方法加以生产与检验[57]。

(3)生物屏障。肿瘤细胞内存在抑制碳纳米载药粒子积累的生物屏障，使碳纳米载药粒子难以深入到肿瘤细胞，或易被吞噬细胞摄取而非肿瘤细胞[58]。人体内也存在着许多影响碳纳米颗粒分布与消除的生理屏障，如血-脑脊液屏障和肾系统等。此外，修饰后的碳纳米颗粒暴露在等离子体等生物流体中，其表面会被各种生物分子所覆盖，形成大分子冠冕，掩盖了碳纳米颗粒的靶向能力，严重地影响了碳纳米载体的肿瘤靶向性[59]。

碳纳米材料在实际应用中存在较多困难，针对以上问题，可以从以下角度思考:(1)切勿过分追求载体的靶向性和药物的有效性而忽略了安全性。对碳纳米材料进行有针对性的修饰，结合多种生物相容性物质，通过合理的修饰来降低碳纳米载药系统对人体的毒性。(2)结合免疫方法。Tonigold等[59]利用了抗体预吸附的方法，在羧基修饰的纳米粒子表面结合抗anti-CD63抗体。预吸附抗体能保持其功能，不被生物分子电晕完全交换或覆盖，大大地减少了大分子冠冕对碳纳米靶向递药的不良影响。

综上所述，继续深入探索碳纳米材料的表面修饰技术及肿瘤靶向技术仍将是该领域的研究重点。而如何实现碳纳米材料载药的安全性与有效性及如何大量制备依然是实现碳纳米材料从实验室走向应用过程中必须解决的难题。相信将来会有更多新的表面修饰与靶向技术能够解决遇到的难题，碳纳米材料在肿瘤药物递送方面将会发挥更大的作用。