非编码RNA在肺动脉高压中的作用

徐 艺,于 锋,刘 云

(1连云港市第一人民医院药学部，连云港 222002；2中国药科大学基础医学与临床药学学院，南京 211198)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是肺高血压疾病的一个分支，其组织学特征是肺小动脉血管收缩、肺动脉重构，进而形成丛状病变，其临床治疗效果不佳[1-2]。PAH诊断的标准为静息时右心导管测得平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)≥25 mmHg、肺毛细血管楔压(pulmonary artery wedge pressure，PAWP)≤15 mmHg 且肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)>2.4×10-3kg·m·cm-5/s的血流动力学状态，同时排除肺部疾病、慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thrombo embolic pulmonary hypertension，CTEPH)及其他不明原因的肺高血压(pulmonary hypertension，PH)[3]。PAH的发生发展与多条信号通路及转录因子有关，包括：HIF-1、NOTCH、BMPR2、STAT3等[4]。尽管近年来在治疗方面有所进步，但是患者的生存率仍低下,寻找新的治疗方法和治疗药物仍然是PAH患者的迫切需求。

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是mRNA 上大量的不能作为翻译模版的转录产物[5-6]。基于分子大小、形状和功能将其分为核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)、转运RNA(transfer RNA,tRNA)、微小RNA(micro RNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、竞争性内源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)、循环RNA(circular RNA,circRNA)、小核RNA (small nuclear RNA,snRNA)等[7]。有证据表明，ncRNA主要通过表观遗传学在基因转录过程中或在转录后对其表达进行调控，由此参与PAH的发生和发展，并且在多学科多领域都具有活跃的功能。

本文从ncRNA中挑选研究比较成熟的miRNA、lncRNA、ceRNA及circRNA，阐述其对肺动脉高压形成机制的影响，希望为肺动脉高压的治疗找寻新的思路。

1 miRNA在PAH中的作用

miRNA是一类内生的、长约22个核苷酸的非编码小RNA[8]。miRNA与目标mRNA通过两种方式发生作用:一是其与目标mRNA的3′非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)不完全互补配对，使得miRNA可以与多个不同的mRNA发生作用，影响基因的翻译过程和蛋白表达水平，但对mRNA的稳定性没有影响[9]；二是miRNA和目标mRNA完全互补配对，导致目标mRNA在互补区特异性基因断裂，导致基因沉默。miRNA通过与目标mRNA的相互作用，参与多种组织及细胞的生理过程，包括发育、分化、增殖、细胞死亡及代谢等，同时也对许多疾病的发生发展产生影响[10]。近年，大量研究表明肺血管中miRNA在维持肺动脉稳态中有重要作用，并且相关miRNA与PAH的多条致病机制有关[11]。

1.1 miRNA与PAH相关的缺氧致病机制

研究表明，慢性缺氧可造成肺血管异常收缩及肺动脉压力升高,并进一步导致肺血管结构发生变化并逐渐导致肺血管重塑[12]，而肺血管的重塑导致肺血管壁增厚，又进一步加重肺部缺氧。虽然缺氧性肺动脉血管重塑的分子和细胞机制还不清楚，但已经有研究表明miRNA在肺血管平滑肌细胞(pulmonary vascular smooth muscle cells,PASMCs)再生导致的肺血管重塑机制中起着关键作用。

有研究显示，miR-210在PAH形成过程参与了PASMCs的增殖作用。研究发现miR-210在慢性缺氧诱导的PAH的小鼠肺组织中被激活。另外，miR-210通过调节转录因子E2F3 (transcription factor E2F3)发挥对人PASMCs促增殖的作用，而miR-210自身的转录依赖于缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)[13]。HIF-1是一个转录因子，在缺氧条件下HIF-1可稳定表达，其在血管生成、细胞存活、葡萄糖代谢、细胞入侵和转移中扮演重要角色[14]。总之，miR-210诱导肺动脉平滑肌细胞抗凋亡作用，促进了肺血管重塑，或许抑制HIF-1和miR-210可以作为缓解PAH的一种治疗途径。

miR-138在PAH的进程中参与了PASMCs的增殖分化和抗细胞凋亡作用。钾离子通道亚家族(potassium channel subfamily K-1，TASK1)在人肺动脉平滑肌细胞中表达，并且参与缺氧肺动脉高压。研究中使用miR-138的模拟物和抑制剂以及TASK-1的抑制剂(A293)验证PAH中他们的作用。研究表明，HIF-1α引发miR-138通过目标基因TASK1促进了人PASMCs的细胞增殖和线粒体去极化作用[15]。

miR-206也在PAH中参与PASMCs的细胞增殖，可能是早期低氧诱导PAH的触发因素。HIF-1和它的调节者Fhl-1在低氧诱导的PAH中扮演着重要的角色。FHL-1(four and a half LIM domain 1,FHL-1)在平滑肌分化、迁移过程中起到调节作用。miR-206通过HIF-1α/FHL-1途径，促进了PASMCs的细胞增殖[16]。

miR-328过表达能减轻肺动脉血管收缩[17]。miR-328促进PASMCs的凋亡作用来减轻肺动脉的重塑。miR-328通过结合L-型钙通道的3′-UTR抑制L-型钙通道表达。进一步研究证实了L-型钙通道和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的转录抑制有关。这些结果表明，miR-328是一种重要的保护因子，通过调节低氧肺动脉高压的多个基因目标，在肺动脉高压收缩和重构中起着重要保护作用。

1.2 miRNA与PAH相关的BMPRII机制

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在许多生理过程中起到调节作用。BMP有超过30多种成员，而BMP4被认为是调节细胞增殖和迁移，调控肺动脉重塑的最重要的因子[18]。BMPRII是一种位于细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸的受体，其对于胚胎形成、发展以及成熟组织的内稳态有非常重要的作用。骨形态蛋白受体Ⅱ型(BMPRII)的失调表达是肺动脉高压的一个病理特征。超过70%的遗传性PAH和20%的特发性的PAH表现为BMPRII杂合突变。BMPRII通过磷酸化来激活BMPRI，被激活的BMPRI通过SMAD(small mothers against decapentaplegic,SMAD)1/5/8转录因子的磷酸化作用将信号传播到细胞内[19]。

miR-17/92基因(C13orf25)的启动子区域中发现了一个高度保守的信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)的结合位点，白细胞介素-6(IL-6)通过这个独特的区域提高了C13orf25的转录。IL-6信号主要是由STAT3介导的，STAT3的持续激活会导致BMPRII的蛋白质表达被抑制[20]。另外，miR-17/92丛基因簇成员miR-20a被拮抗之后，BMPRII表达增加，并且抑制血管重塑的形成。综上所述，miR-17/92-BMPRII途径为肺动脉高压发展中BMPRII 的缺失提供了合理的解释[21]。

1.3 miRNA参与PAH相关的Notch信号途径

Notch信号通路在细胞的增殖、凋亡和分化过程中起着关键作用，在生物进化过程中高度保守[22]。Notch受体信号与维持平滑肌细胞的增殖及其平滑肌细胞状态有关。肺动脉平肌细胞中过度表达Notch3是人类肺动脉高压的特点之一。从Notch3受体发出的信号，通过转录因子HES-5蛋白质抑制平滑肌细胞的增殖，并转移到未分化的平滑肌细胞表型，这些结果表明，Notch3-Hes-5信号通路对肺动脉高压的发展至关重要，并为治疗干预提供了目标途径[23]。

miR-124直接调节肺动脉高血压/特发性肺动脉高压纤维母细胞的单核细胞趋化蛋白-1(PTBT1)表达。miR-124对成纤维细胞增殖的影响是通过其直接结合到PTBT1的3′-UTR以及随后其对Notch1/p27Kip1信号的调控作用。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制了miR-124的表达，并通过HDAC抑制剂治疗高血压成纤维细胞，增加了miR-124的表达，减少了增殖和PTBT1的产生[24]。miR-124表达的稳定减少导致了高血压肺外成纤维母细胞的表观遗传重组、高度增殖、迁移和炎症表型[25]。因此，用于恢复miR-124功能的治疗方法，包括PTBT1抑制剂，可能成为治疗PAH的新思路和新方法。

1.4 miRNAs与PAH相关的STAT通路

STAT蛋白家族对多种细胞功能具有调节作用。STAT家族包括7种亚型(STAT1-4、5A、5B和6)，其中STAT3在PAH形成中具有重要作用。STAT3能以磷酸化形式激活细胞因子调节各种目标基因的表达，包括细胞周期调控因子、血管生成因子和抗凋亡基因等，并促进PAH的发生。

miR-204异常表达与PAH发生发展过程中STAT3的不适当激活相关。1,25(OH)2D3通过miR-204、P21和SMAD2的诱导表达，使得低氧诱导肺高压的增殖和迁移减少了，这与重组人转化生长因子β受体-2(Tgfbr2)、Sma和Smad7的抑制表达有关。此外，荧光素酶的报告分析发现Tgfbr2是miR-204的直接目标。对miR-204的过度表达和对Tgfbr2的抑制将增强1,25(OH)2D3的效果。目前的研究结果表明，1,25(OH)2D3是一种很有前途的治疗方法[26]。另外，有研究表明STAT3的激活可抑制miR-204的表达，而miR-204直接抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶-2(SHP-2)，因此STAT3通过下调miR-204的表达解除了对SHP-2的表达抑制，从而激活病毒癌基因Src激酶和T细胞激活的核因子(NFAT)，而NFAT和SHP-2对PASMCs均有促增生和抗凋亡的作用[27]。

另外，如前所述，miR-17/92簇参与了BMPRII的表达调控，这一调控作用亦通过STAT3通路实现。

2 lncRNA在PAH中的调节作用

lncRNA是在真核生物中发现的一类长度大于200 nt的非编码RNA分子，具有mRNA样结构[28]。LncRNA可以通过剪接形成与启动子具有结合能力的polyA尾，参与分化过程中基因的动态表达。LncRNA生物学的功能包括：保护染色体完整性、维持基因组结构、在X染色体活跃性、印痕、转录、翻译和表观遗传调节方面的不同结构和管理作用[29-30]。

2.1 lncRNA在PAH中的作用

血管平滑肌细胞从分化表型向增殖表型的转变促成了很多血管性疾病。

研究发现缺氧导致一些lncRNAs(IGF2-AS、OIP5-AS1、TERC)的表达下调了，而LUCAT、MALAT1、MIAT、NEAT1、ST7-AS1、ST7-AS2的表达上调了[31]。LncRNA CHRF作为内源状海绵体miR-489提供者[32]，下调了miR-489的表达，并且调节了髓样分化因子Myd88的表达。

自噬是一种高度保守的复杂分解代谢过程，大约有30个自噬相关蛋白(ATGs)以及各种信号通路参与其中。在这些蛋白中,自噬相关蛋白7(ATG7)起着至关重要的作用。自噬影响血管平滑肌细胞的许多功能，包括增殖，迁移、收缩、松弛和分化。自噬也可能调节血管平滑肌细胞表型转换。LncRNA APF作为miR-188-3p海绵体的提供者，不但减少了ATG7的退化，同时也影响ATG7在调节自噬和心肌梗塞方面的作用。

肺腺癌转移因子(MALAT1)的低表达影响平滑肌细胞的增殖[33]。血小板衍生生长因子(PDGF)引起细胞的增殖和迁移可以通过MALAT1的敲除进行抑制。PDGF引起的细胞吞噬也可以因为MALAT1的敲除而抑制。

通过对5位CTEPH患者和健康人lncRNA表达图谱的对比发现，在185个lncRNA中，只有小部分的lncRNA发生了明显的上调或者下调。LncRNA NR_036693是一个5 255 bp人类C型凝集素家族2转录变异体6，这个基因编码了一系列自然杀伤细胞受体C-型凝集素家族，该家族可以导致肺动脉高压。NR_027783是一个1 199 bp来自于人类亚精胺N1乙酰转移酶1(SAT1)的转录变异本2，该基因编码乙酰转移酶家族的成员，是多胺代谢中的限速酶。很多研究表明，药理学上，聚胺调控通路是肺动脉高压治疗领域的靶点。最后，NR_033766是一个6 384 bp来自人类叉头家族P2(FOXP2)转录变异本7，叉头家族基因参与胚胎发育过程中控制速度和语言的大脑区域的发育。另外，FOXP2可能和一系列的生物通路和级联有关，而且影响语言的发育。

人母系表达基因(MEG3)位于人类基因组14q32.3染色体[34]，是属于DLK1-MEG3基因上的一种印记基因[35]。研究发现敲除MEG3可以影响人肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，上调细胞S期和G2/M期的细胞比例。这个过程可能直接或者间接影响了PCNA和Cyclin蛋白家族。进一步研究发现MEG3依靠调节miR-21的表达来发挥其作用，另外研究发现MEG3通过miR-21/PTEN在正常组和缺氧组肺动脉平滑肌细胞中都扮演重要的角色[36]。

3 其他ncRNA在PAH中的调节作用

3.1 circRNA在PAH中的调节作用

近年来发现，在真核多细胞生物中还存在一类数量众多的非编码RNA,即circRNA。最初，circRNAs 被认为是无功能的普通拼接处理的副产品。到目前为止关于circRNAs的研究还没有完全阐明。一些circRNAs已经被证明可以转化为蛋白质。有研究利用微阵列分析来确定小鼠肺组织中circRNAs的表达谱，并确定了23个显著的升高和41个显著下降的circRNAs[37]。Circznf609可以被翻译成一种特殊控制的小蛋白质促进平滑肌细胞的增殖[38]。这些独特的circRNAs为理解各种疾病的生物机制带来了新的视角，包括心血管疾病、肿瘤、神经障碍糖尿病等[39]。

3.2 ceRNAs在PAH中的调节作用

竞争性内源性RNA(ceRNAs)是一种新颖的基因调控因子，ceRNAs之间通过共享的miRNA在许多疾病的进展中扮演重要角色。有一些ceRNA的干扰已经被证实了，比如PTEN、FOXX1、AEG-1等。PTEN是一种有效的肿瘤抑制因子支配多个细胞过程，包括生存、增殖和能量代谢[40]。星状细胞提升基因1(AEG-1)具有调节血管生成的功能，在肿瘤发展过程中向上调节负责肿瘤的血管生成的相关蛋白[41]。另外一些研究，比如circRNA HRCR和他的ceRNA伴侣可以抑制心脏肥大和心衰[42-43]。

4 总结与展望

肺动脉高压(PAH)是一种严重危害人类生命健康的疾病，目前缺乏有效的治疗药物。对PAH的发病机制以及对潜在治疗目标的探究，仍是一个迫切的问题。ncRNAs在PAH中的研究主要集中在miRNA、lncRNA、cirRNA、rasRNA、ceRNA，其他ncRNA与PAH的作用研究很少，其他ncRNA也可能参与PAH相关疾病的发展。其中miRNA的研究相对成熟，其表达异常显然是与特定疾病相关,有可能成为PAH发生发展及在疾病诊断中生物标志物。但miRNA对目标mRNA的转录影响可以促进肺动脉高压的形成也可以抑制其形成,这需要更加深入的研究miRNA与其目标mRNA的相互作用，进一步筛选有潜力成为PAH诊断和治疗药物的miRNA。