SSR分子标记及其在茶树DNA指纹图谱上的应用

蔡一鸣，吕 未，吴淑平，赵丰华，吕立哲

（信阳市农业科学院河南省茶叶工程技术研究中心国家茶叶产业技术体系信阳综合试验站，河南信阳464000）

近年来，伴随着生物技术的快速发展，分子标记技术被广泛应用于茶树品种研究中，目前研究中常用的分子标记有RAPD（Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA）、AFLP（Amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性），ISSR （Inter-simple sequence repeat，简单重复区间序列）、SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）。较其他分子标记，SSR分子标记因其多态性高、数量丰富、可重复性好、多等位性、共显性以及对基因组有很好的覆盖性等[1]特点优势，逐步成为目前茶树DNA水平上研究的主流分子标记。SSR分子标记的不断开发与应用，对研究茶树遗传多样性、亲缘关系分析、品种鉴定、种质资源的创新、茶树指纹图谱库的建立、分子辅助育种等方面都具有重要的现实意义。而茶树DNA指纹图谱的构建可以有效的鉴别茶树品种、保证苗木纯度、保护茶树品种权益等。

1 SSR分子标记

1.1 SSR分子标记的概念

真核生物的基因组中，含有大量的重复序列，根据其在染色体上的分布可将其分为串联重复序列和散布重复序列。而散布重复序列因其拷贝数量很大，在重复单位间常有序列变化，难以进行分子标记。串联重复序列可以根据重复单元数量的不同分为卫星序列、小卫星序列、微卫星序列。微卫星 DNA，又名 SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列），是由1～6个核酸为基本单元组成的长度达几十到几百bp的一段DNA。SSR在真核生物基因组中的含量非常丰富，且随机分布，由于重复次数的不同，导致SSR在不同种或者个体间存在高度变异，表现为多个位点的多态性。关于SSR分子标记的产生有很多说法，但目前普遍认为SSR的产生是由于DNA复制过程中的滑动错配导致[2]。为了将这些变异行之有效地揭示出来，SSR分子标记应运而生。随着研究的不断深入，SSR标记被不断地开发应用，已然成为分子标记领域的热点研究。

1.2 SSR分子标记的开发

每个微卫星DNA的侧翼序列即两翼DNA序列，是相对保守的单一序列，可以根据两翼保守序列设计一对SSR引物，用于多态性分析。SSR引物的开发是SSR分子标记的关键因素，目前SSR引物开发的途径主要有以下4种[3]：（1）查阅相关文献，获得相关SSR分子标记引物，这种方法效率最高，但此方法使用受限，只限于已有引物开发出的物种；（2）利用近缘物种的SSR引物，此方法盲目性很大，其在所研究物种上的多态信息含量如何，不得而知；（3）从NCBI等数据库中搜索有关物种的DNA序列或者EST序列以获得SSR序列，设计引物，该方法简便有效，随着EST序列的不断开发，EST-SSR分子标记在茶树、杉木、小麦等作物中的应用也越来越多；（4）通过构建SSR基因组文库，开发本物种的SSR引物，此方法较前3种方法稍显复杂，但也是最根本和最有效的途径，保证多态信息水平。

2 茶树DNA指纹图谱

2.1 DNA指纹图谱原理

随着高度变异的DNA序列的发现，1985年Jeffreys等[4]利用一段核心序列合成的探针与人的基因组酶切片段进行Southern杂交，获得了10多条杂交谱带，进一步研究发现，不同个体间杂交谱带的位置千差万别，这些图谱的发现，就像人的指纹一样因人而异，因此得名DNA指纹图谱。在法医学、人类遗传学、植物学以及鸟类和哺乳动物的研究中都有广泛应用。DNA指纹图谱是指在DNA水平上，通过分子标记鉴别不同生物个体之间差异性的电泳图谱，与传统的形态和生化鉴定相比，具有高度的个体特异性和稳定性，包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR和SNP等。DNA指纹图谱的构建应遵循以最少的引物或者引物组合，鉴别大量品种的原则，将电泳条带转换成基因型代码，结合核心引物名称及育成品种单位缩写等信息，生成另一种形式的DNA指纹图谱，像人类身份证一样，拥有唯一性[5]。

2.2 SSR指纹图谱在茶树上的应用

通过SSR分子标记构建DNA指纹图谱也叫SSR图谱，因SSR分子标记的诸多优势，已成为目前茶树指纹图谱构建的主要途径。特征谱带法、引物组合法与核心引物组合法是DNA指纹图谱分析的三种主要方法[6]。刘本英等[7]用EST-SSR标记28份茶树品种时，只有12个品种在17个引物位点上有特征谱带，故使用特征谱带法，只能鉴定12个品种，如果想获得其他品种的特征谱带，需要大量的引物筛选工作，且随着品种数量的增加，之前在某品种上出现的特征谱带，有可能在其他品种上出现相同带型，因此，特征谱带是相对的，只有在固定样本中有效，鉴定能力有限，而使用22个引物组合，可将28个品种全部区分开。目前在指纹图谱研究中，主要使用的还是引物组合法及核心引物组合法。王松琳等[8]通过SSR分子标记选取3对核心引物，构建了16个白化、黄化的茶树品种的指纹图谱，将全部品种区分开来。章志芳等[9]利用EST-SSR标记筛选出4个核心标记构建了14个茶树新品种的指纹图谱。陈世军等[10]使用SSR技术，筛选出6对引物用于黔南60个野生茶树品种的指纹图谱构建。黄丹娟等[11]从30对SSR引物中筛选了3对核心引物构建了湖北省13个优良茶树品种的CID图谱，可直观显示整个鉴别过程，快速查找出各参试品种鉴定所需的引物及其对应基因型。郭燕等[12]利用4个SSR核心标记构建茶树指纹图谱，鉴别40份贵州古茶树资源。由此可见，SSR图谱可以有效鉴别茶树品种。

3 存在的问题及展望

随着SSR分子标记在茶树指纹图谱研究中的应用，一些问题也随之而来，比如在SSR检测方法上，目前应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 银染检测，毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）荧光检测是近年来刚刚起步的一种高效电泳，相较于CE，PAGE成本低，但费时费力，工作效率低，检测精度和通量都不高。而且PAGE读带时因人为因素导致误差很大，而CE可在PCR技术后实现高度自动化，通过软件实现自动读带，减少误差提高工作效率。在试验样本较多时，可以将两种检测方法相结合使用，先用PAGE进行SSR标记初筛，对筛选出的标记用CE分析，提高准确度。

单一分子标记技术构建指纹图谱的报道很多，但为使DNA图谱结果更准确、可靠，有时用两种或者两种以上的分子标记进行植物的分析和评价。巫桂芬等[13]采用SRAP、ISSR和SSR三种分子标记绘制了154份黄麻指纹图谱，结果表明，不同品种有的只能用一种标记获得其身份证指纹，有的可由2种或者3种标记获得。由此可见，结合多种分子标记的方法，可利用不同分子标记的优点，解决单一分子标记中出现的难题，以此获得更全面的分子信息。刘振等[14]使用SSR、SRAP、ISSR分子标记鉴别湘波绿2号的父本，比较了3种分子标记在不同评价指标中的适用性。张羽等[15]比较了EST-SSR、SRAP及SCoT三种分子标记在茶树遗传多样性和亲缘关系上的标记效率及多态信息，认为不同标记可以揭示不同的位点信息，虽然标记结果有差异但互不排斥，也不互相取代，可综合使用多种标记更好的分析品种间遗传多样性。随着品种数量的增加，引物的不断开发，利用多种分子标记优势互补构建茶树资源指纹图谱必然成为最佳选择。

2017年中国首次破译茶树基因组，测序后发现，这个茶树基因组序列达到了3.02亿个碱基对，总共从里面注释出36 591个编码基因。茶树基因组测序的完成有利于开发更多的SSR标记，使构建的茶树指纹图谱覆盖整个茶树基因组[16]。

目前，虽然茶树指纹图谱报道很多，但构建图谱的标准却各不相同，缺乏一套统一标准，如茶树DNA提取方法、PCR反应体系、电泳检测等；鉴别品种所需的核心引物；差异位点数等[17-20]。2013年以来，农业部相继颁布了大麦、小麦、百合、高粱等16个农业植物品种DNA指纹图谱鉴定技术规程的农业行业标准，为茶树标准指纹图谱构建提供了借鉴和指导[5]。因此，构建茶树DNA指纹图谱的统一技术标准，已经成为我国近期开展该方面工作的重点，对实现茶树DNA指纹图谱的数字化、自动化、标准化有着重要意义[21-22]。

豫南茶树种质资源丰富，但开展分子水平的研究起步较晚，且研究范围不够宽，2016年苏会等[23-24]利用EST-SSR标记开展对豫南茶树种质资源茶品质相关性状的关联分析，以及性状与成分多样性分析。本文总结了SSR分子标记技术及其在构建茶树DNA指纹图谱上的应用及存在的问题，旨在为豫南茶树种质资源的创新利用，指纹图谱的构建提供一定的参考和借鉴。