组织与细胞培养在植物育种中的研究进展及其应用

龚建军，镡美霞

（武威职业学院现代农业技术系，甘肃 武威 733000）

植物组织与细胞培养体系在育种研究和商业应用中具有巨大的潜能，在商业应用和细胞生物学、遗传学、生物化学等基本研究中发挥着越来越大的作用。自德国植物学家G.Haberlandt发表关于植物叶肉细胞培养的研究开始，植物组织与细胞培养技术已经过110多年的发展，现在已成为科学研究的工具和加快生产进程的途径。随着植物组织与细胞培养技术的逐渐完善，其在植物遗传育种等领域的应用越来越广，为植物新类型的创造和培育优良作物品种以及生产次生代谢物质（如医药、香料等植物化学成分）等领域开辟了新的途径；随后，在生产中涌现出许多应用成功的案例，发展速度比预期要迅速，但也面临很多困难和障碍。目前，植物组织与细胞培养在植物育种方面取得了以下几个方面的较大进展。

1 种质资源保护

种质资源是人类用以植物遗传改良和发展农业生产的物质基础，是生物多样性和生态系统多样性的基础，也是农业生产中必不可少的繁殖材料。植物育种工作离不开种质资源的定期繁育复壮。种质资源种类繁多，特征特性各异，保护、开发利用种质资源关系到人类的生存条件和经济条件。一方面常规的种质资源收集、保存、研究和利用，需要建立保护圃或保护地，不仅需要大量的人力、基础设施和技术路线研究，而且容易遭受自然灾害威胁、病虫害侵袭，造成有益种质资源的丢失；另一方面，科研单位缺乏种质资源保护配套设施，保存的数量有限，时间短，也容易丢失。据报道，若要保存800个品种的葡萄种质，需占土地1 hm2，养护费用十分高昂。植物组织与细胞培养所用的试验材料取材少，利用不同外植体培养结合低温、超低温冷冻贮藏可保存种质资源，保存和繁殖所需的空间比田间栽培要小得多，生长周期短且繁殖系数大，培养效果好，病虫害少，便于种质资源的交换和转移。如将葡萄茎段经组培形成的组培苗保存在试管中，温度调控在9 ℃以下，植株就会停止生长，每年只需转管1次，这样800个葡萄品种，每个品种6个重复，只占用2 m2。许多植物都可采用这样的试管繁殖方式，低温保存，每年转接1～2次，就可长期保存，也可以随时把培养物转移到常温的条件下，利用组织与细胞培养技术，将其进行快速繁殖并广泛应用。

2 优良品种快繁及脱毒

利用组织与细胞培养技术可以进行工厂化生产，实现优良品种的快速繁殖，得到无病毒植株。由于脱毒苗能较好保持原有的优良性状，植物快繁及脱毒已成为解决病毒病危害和品种退化的一个新途径。植物组织与细胞经初代及继代培养获得完整的植株，遗传性稳定，突出特点是在短时间内获得数量庞大的新株系；因此，对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的植物，这项技术是实现商品化生产的最佳途径，比常用方法繁殖的速度快数百万倍，是植物组培快繁技术应用在生产实践上最广泛、成效最大的实例。1960年Morel提出离体无性繁殖兰花的方法。Seeni等[1]在火焰兰的叶基部成功诱导出嫩芽，获得再生植株。Chang等[2]以寒兰根状茎为材料经培养获得再生植株。

用于组织与细胞培养快繁的植物种类繁多，包括花卉观赏植物（草本、乔木、灌木和藤本）、经济作物（蔬菜、果树、大田作物）及药用植物（鸭脚树、人参、红豆杉等）。脱毒苗可以提高产品的质量与产量，目前国际上无病毒苗木研究机构有：国际热带农业研究中心（IITA）、国际马铃薯研究中心（CIP）、亚洲蔬菜研究中心（AYRDC）。自1978年以来，美国、新西兰、荷兰等国家已经开始用不同树木的组培苗进行小面积造林，1983年我国的林木组培苗研究已从实验室走向工厂化大生产、走向市场。离体快繁的特点是培养条件可以人为控制，生长周期短，经济高效，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。对于名优特植物、常规繁殖容易但易感染病毒的植物、杂合型园艺植物、有性不亲和与不育的基因型植物等，离体快繁是一个有效的手段，并将带来巨大的经济效益[3]。

农业生产中，许多无性繁殖植物，如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等都带有病毒，根据病毒在植株中分布不均匀，但在植株生长点附近细胞的病毒浓度很低且病毒的含量随植株部位和年龄而异的原理，通过茎尖分生组织培养或结合其他处理，再生植株可有效脱除病毒，获得脱病毒小苗。马铃薯的脱毒培养是茎尖培养最成功的案例之一。目前，生产上培育并已成功应用的无病毒植株有马铃薯、甘薯、大蒜、草莓、甘蔗、菠萝、香蕉等，一般草莓脱毒苗可以提高20%～50%的产量，并且果个大、形好、畸形果少、口味好[4]。外植体已不仅限于茎尖，未成熟或成熟的胚、叶（花）原基、单个游离细胞、原生质体等都可以应用这一培养技术。

3 诱发和离体筛选突变体

细胞和组织培养是扩大变异的有效途径，诱发和离体筛选突变体技术是一种高效的种质资源创新方法，为抗逆育种提供了新思路。利用细胞和组织培养中培养的细胞易受培养条件和诱变因素（如射线、化学物质、胁迫处理等）的影响而发生变异的原理，进行突变的诱发，进而从中筛选出有用的突变体，最终育成新品种。大量试验表明，利用离体筛选技术获得的突变体在创新抗性材料方面发挥了重要作用。目前，已筛选出的抗性突变体类型有：抗烟草花叶病毒（TMV）和抗除草剂的番茄，抗马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒（PVY）的马铃薯，辣椒、番茄、亚麻等抗寒突变体，番茄、棉花等耐盐突变体，茄子抗线虫、螨虫和黄萎病突变体，甘蓝型油菜抗Basta除草剂和抗菜蛾害虫等多种变异类型。一些作物离体培养期间体细胞无性系变异频率高达10%～15%，从中可获得大量有价值的突变体材料，经过定向选育及抗性鉴定，筛选出一定的目标性状，得到新种质变异体[4]。与诱变育种相比，诱发和离体筛选突变体技术具有变异频率高、育种周期短、育种方向性强等优越性，已成为细胞工程领域的研究热点，用来实现作物品种改良，获得更多有价值的抗病种质材料，在基因资源等方面的应用将会更加广泛。

4 克服远缘杂交困难

植物组织与细胞培养和远缘杂交相结合是克服远缘杂交育种中杂种夭亡、杂种后代中间类型不稳定等困难的有效途径。试管授粉受精和幼胚培养作为解决种间、属间等远缘杂交中杂种胚停止发育和杂种F1不结实等问题的手段，克服了常规有性的远缘杂交杂种后代分离时间长、稳定慢的缺点，在很多种植物上获得了成功。Laibach培养亚麻种间杂交幼胚获得成功并得到了杂种，证明胚培养在植物远缘杂交上可利用，从而开创了植物胚胎培养的应用。

常规育种中杂交不亲和是很大的障碍，胚胎在发育初期就出现障碍并停止发育，导致很难进一步生长发育形成幼苗，但通过胚珠培养或子房培养，可促进原胚继续胚性生长，使幼胚发育成熟，挽救濒临中途败育的杂种胚，获得远缘杂种植株，也是进行种子发育机理等方面研究的一个有效方法，为试管受精提供一项基础技术。1996年，用桃的胚培养成功克服了杂种胚败育的问题；甜菜（野生种×栽培种）后代杂种胚离体培养诱导得到再生植株，为野生甜菜资源潜力的发掘利用开辟了新的途径[5]。植物组织与细胞培养在远缘杂交育种中显著地扩大和丰富了植物育种的基因库，改良了栽培品种的品质，合成了新的物种，为研究物种的进化提供了试验依据。龟谷和日向用芸薹类植物胚珠培养得到了杂种植物，我国西北生物研究所进行的小麦雌蕊离体授粉和烟草胚珠试管受精试验均获得了成功。

5 单倍体育种

植物花药培养与花粉培养可获得纯系材料进行单倍体育种，克服远缘杂种的不育性及杂种分离；对于异花授粉植物，可快速获得自交系，提高育种效率。通过花药或花粉培养发育成的单倍体植株，经过染色体加倍获得纯合二倍体材料进行植物遗传规律研究，可减少育种的盲目性，在短期内育成遗传变异稳定的具有优良性状的个体。自1964年Guha等获得曼陀罗的花粉单倍体植株以来，通过花药或花粉培养的单倍体育种技术，已经作为一种崭新的育种手段应用于烟草、水稻、小麦、玉米、辣椒、草莓、苹果以及许多药用植物如枸杞、人参、平贝母中[6]。Raina等通过茄子花药培养最早获得茄子双单倍体；1974年我国育成了世界上第一个单倍体作物新品种——单育1号烟草品种；Eber等通过培养甘蓝型油菜单倍体植株的小孢子获得非整倍体植株。

对于花药培养诱导率过低和雄性不育的植物，在人工控制的条件下诱导大孢子或卵细胞增殖，形成单倍体植株。目前，单倍体植株的获得主要是对花粉或花药和未受精的子房和胚珠进行离体培养[7-9]。试验证明，甜菜未授粉胚珠培养比花药培养诱导率高，西葫芦单核期的花药和当日开花未受精的子房愈伤组织诱导率最高，洋葱开花前3～5 d的子房诱导频率最高且有很高的遗传稳定性。朱至清设计N6花药培养基，不仅在国内得到推广，而且在国外也被采用。此外，花粉植株的性状变异率较胚珠培养获得的单倍体植株高，在禾本科植物中，花粉植株试管苗玻璃化率较高，而子房和胚珠培养获得的单倍体植株试管苗玻璃化率较低。

6 基因工程的基础技术

植物分子遗传学的研究离不开组织与细胞培养技术手段，转基因技术克服了植物育种中的盲目性，快速有效地创造遗传变异，是实现植物改良、增加产量和改善品质的一项新技术。通过根癌农杆菌介导法，可获得生根率达80%以上的甘蓝型油菜抗性再生植株；N P TⅡ基因、抗虫基因都已成功导入茄子。近年来，植物组织与细胞培养技术广泛应用于大田作物、蔬菜、林木、花卉、禾本科牧草、药用植物的抗性及单性结实等方面，目前已有100余种植物成功获得转基因植株，如利用基因转换得到茄子的单性果实，利用农杆菌介导法提高紫花苜蓿中缩合单宁的含量，大白菜抗生素潮霉素和抑菌抗生素特美汀转基因植株的获得，组织培养体系和遗传转化体系改良马铃薯品质的建立，转基因抗除草剂大豆、延熟番茄等的产业化。

愈伤组织遗传转化体系的建立为目的基因导入及次生代谢产物生物合成的研究奠定了基础。1990年，我国自行研制的抗烟草花叶病毒烟草在辽宁进行商品化种植，成为世界上第一例商品化生产的转基因植株。虽然对转基因生物及产品存在一定的质疑，但基因工程技术在面临资源匮乏、粮食短缺等全球性问题上突显了巨大潜力，赋予传统植物新的特性，提高植物的抗性、产量及品质，有利于植物的大面积种植和保护，且产生了一定的经济效益和社会效益。在发展基因工程过程中，转基因产品的安全性也应受到重视，应该建立一套科学的安全性评价体系和判断标准，在保证安全性的前提下，保护和促进我国农产品贸易和农业生物技术产业的发展，促进转基因技术在植物研究和应用领域健康、可持续发展。

7 小结

综上所述，植物组织与细胞培养技术近年来得到了广泛的关注和发展。目前，已扩展到植物生长学、生理学、胚胎学、细胞学、遗传学、病理学等领域。特别是近20年来，植物组织培养不仅在基础的理论研究上具有重要价值，而且在实际应用中越来越显示出其优越性，已成为从实验室研究到大规模工业化育苗的新技术，广泛应用于农业、园艺、林业、医药等领域。此外，与传统的优良种质材料的繁殖和保存、突变体的诱导和筛选等方法相比，该技术在时间和空间上具有更大的优势。总之，植物组织与细胞培养技术将深入到人们的生产、生活、科研等各个领域，并将得到不断提高。