骨肉瘤不良预后相关基因研究进展*

黄镇 李晓东 黄庆山 林建华

（福建医科大学附属第一医院骨科，福州350005）

骨肉瘤是一种常见于青少年的原发性恶性骨肿瘤[1]。70%～80%的骨肉瘤患者发病年龄为10～25岁每年发病率为（1～3）人/100万人[2]。尽管骨肉瘤的发病率远低于常见恶性肿瘤，但是由于该病好发于青少年长骨时期，最常见的病变部位为生长活跃的股骨远端、胫骨近端的干骺端[3]，起病时无典型的临床症状极易与外伤混淆，且恶性度高，早期即可能发生肺转移[4]，危害性大，死亡率高[5]。随着治疗方案的改进，骨肉瘤患者的5年生存率在过去的十多年里仍维持在70%左右[6]，出现其他部位转移的骨肉瘤患者5年生存率更低[7]。因此，近年来有许多学者着重研究骨肉瘤不良预后相关基因，这些基因的阐明将为寻找新的治疗方法提供理论基础，以改善骨肉瘤患者的不良预后。目前骨肉瘤不良预相关基因主要可分为ErbB基因家族、癌基因、miRNAs及其他四大类[8]，本文对以上四类具有代表性的骨肉瘤不良预后相关基因的研究进展作一综述。

1 ErbB基因家族

ErbB基因家族属于酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族，主要包括4种跨膜受体：ErbB1（EGFR）、ErbB2（HER-2）、ErbB3（HER-3）和ErbB4（HER-4）[9]，其在肿瘤发生过程中的作用已在多种恶性肿瘤中阐明，一般是通过形成同源或异源二聚体而被激活的。

1.1 EGFR基因

EGFR基因与多种恶性肿瘤的相关关系目前已经明确，并且其主要为不良预后的相关指标，Kersting等[10]利用免疫组织化学技术和荧光原位杂交技术对所收集的骨肉瘤标本进行实验研究，并且分析了EGFR的表达与完全事件生存率和无事件生存率的相关性，EGFR基因低表达患者的生存情况明显较高表达患者差，且差异有统计学意义（P＜0.05），证明了EGFR基因低表达是骨肉瘤患者不良预后的一个指标。

1.2 HER-2基因

HER-2基因是目前研究最为广泛且研究比较透彻的ErbB受体家族成员，其单克隆抗体药物注射用曲妥珠单抗（商品名赫赛汀，Herceptin）已经成功地应用于HER2阳性的早期乳腺癌的辅助治疗，与紫杉醇联用一线治疗HER2阳性的转移性乳腺癌，单药治疗已接受过一种或多种化疗方案的患者以及与化疗药物联用治疗先前未经治疗的HER2阳性的转移性胃癌或胃食管连接部癌症。HER-2基因是最初于20世纪80年代在大鼠的神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤的DNA中发现的一种转化基因[11]。该基因位于人类第17号染色体长臂（17q21-q22）[12]，该基因编码相对分子质量为185 000跨膜蛋白，与表皮生长因子受体有显著同源性，是酪氨酸激酶受体家族成员[13]。该跨膜糖蛋白分主要为胞外段、跨膜区、胞内段三部分，胞内段为内源性酪氨酸激酶活性的功能区[14]。HER-2单体本身不具有激活活性，需要形成同源二聚体或者异源二聚体后才具有活性[15]。HER-2基因与乳腺癌的关系已经明确，在乳腺癌中HER-2基因的过表达与不良预后存在明显相关性[16]。Geller与Gorlick[17]采用免疫组织化学技术对收集的53例骨肉瘤标本HER-2基因的表达进行检测，并且分析其表达量与治疗反应及预后的相关性，发现HER-2的过表达与术前化疗后肿瘤细胞凋亡情况有显著相关性，HER-2过表达患者的无事件生存率明显较低。Zhou等[18]则对25例早期预处理的骨肉瘤标本和12例肺转移的骨肉瘤切除标本进行研究，采用了免疫组织化学和荧光原位杂交这2种技术检测HER-2基因及其表达情况，认为HER-2的高表达可能是与早期转移相关的侵袭性肿瘤表型的特征。因此，骨肉瘤患者HER-2基因的过表达可以认为是预后不良的一个信号，但是HER-2基因在骨肉瘤中的过表达又引发了人们对于使用其单克隆抗体进行靶向治疗的思考。

1.3 HER-4基因

对于HER-4基因在骨肉瘤发生、发展过程中的作用目前还不明确，但相关研究表明，在骨肉瘤细胞株HOS与MG63中，通过病毒转染，使HOS与MG63细胞株过表达与敲减HER-4基因，过表达组HOS与MG63细胞株较敲减组均表现出明显增强的迁徙、增殖能力。Hughes等[19]采用免疫组织化学技术、q-PCR、蛋白印迹、流式细胞术对所收集的骨肉瘤标本进行实验分析，结果表明，HER-4的表达在大多数骨肉瘤中都是起激活和信号传递的作用，而且与骨肉瘤患者的不良预后明显相关。从而论证了HER-4基因是骨肉瘤患者的不良预后相关基因。

目前对于HER-3基因与骨肉瘤预后的关系缺乏相关报道。

2 癌基因

癌基因是基因的一类，是人类及动物的固有基因，又称为转化基因，癌基因激活的结果是使细胞过度增殖及获得其他恶性特征，从而形成恶性肿瘤。目前，与骨肉瘤预后相关的癌基因主要有p53基因、RB1基因及PTEN基因。

2.1 p53基因

P53基因是一种肿瘤抑制基因，在50%以上的恶性肿瘤中会出现这种基因的突变，由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着延缓或监视的作用。细胞中抑制癌变的基因p53会判断DNA变异的程度，如果DNA变异较小，p53基因就促使细胞自我修复；若DNA变异较大，p53基因就诱导细胞凋亡。Yao等[20]对目前相关的p53基因与骨肉瘤的研究结果采用meta分析，认为p53基因阳性表达者与2年生存率差和2年内高死亡风险密切相关，p53基因的过表达增加了早期肿瘤发生风险[21]，相关研究通过对骨肉瘤标本进行二代测序分析得出RB1和（或）TP53基因突变占47%[22]。且Velletri等[23]通过基础研究得出p53基因在保持小鼠骨组织的成骨与破骨的平衡中起着至关重要的作用。其研究结果将会增加人们对于p53基因在骨生物学中的作用的认识，并为寻找新的治疗策略和发现新的治疗靶点提供帮助。

2.2 RB1基因

RB基因也是一种肿瘤抑制基因，是最早发现的抑癌基因[24]。RB1基因编码的蛋白主要分布于细胞核内，是一类DNA结合蛋白，是可控制驱使细胞进入分裂过程的重要基因。Xu等[25]采用全基因组测序、生存分析、蛋白印迹等技术对13例原发骨肉瘤标本进行检测，得出结果认为RB1基因缺失在骨肉瘤的早期发生发展过程中明显存在，并与早期的肺转移与不良预后有相关性。部分研究将RB1基因导入肿瘤细胞中，引发其高表达该基因，并且种植在裸鼠身上，结果显示，高表达该基因的肿瘤细胞成瘤能力明显弱于正常表达者及低表达者。因此，临床医师可以考虑是否能通过RB1基因表达的蛋白药物来对骨肉瘤进行治疗。

2.3 PTEN基因

PTEN基因是于1997年发现的一种经典的抑癌基因[26]。其编码蛋白磷酸酯酶与张力蛋白是同源物，具有磷酸酶活性，可以调节磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的水平，从而抑制磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinases，PI3K）信号通路。PI3K信号通路在细胞新陈代谢、生存、增殖、细胞凋亡、生长和迁移中起着非常重要的作用，PTEN也因此可以发挥其肿瘤抑制的功能。PTEN基因的表达在多种人类恶性肿瘤中明显降低，如乳腺癌、前列腺癌[27]。Hu等[28]利用野生型PTEN质粒转染骨肉瘤细胞，结果表明，PTEN转染后，骨肉瘤细胞中PTEN转录和蛋白发生过表达。此外，PTEN转染后细胞的转移、侵袭和黏附能力均明显低于未转染PTEN的细胞。Xi与Chen[29]研究了PTEN在骨肉瘤细胞系中的表达，发现PTEN在骨肉瘤中的表达较正常成骨细胞有所下降，PTEN的缺失表达刺激了骨肉瘤的生长与转移，并且认为利用基因治疗恢复PTEN基因的功能是潜在的治疗骨肉瘤的一个方向。

3 miRNAs

miRNA是一类长度为19～24 nt的非编码单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因的3'-UTR区部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而起到转录后调控靶基因表达的作用。越来越多的研究表明，miRNAs具有癌基因或抑癌基因的作用，它在细胞的生长、增殖和凋亡过程中发挥着重要作用，其表达水平的异常与许多肿瘤的发生、发展相关[30]。miRNA的异常状态在骨肉瘤的发生发展中扮演着重要的角色，并且一直都是研究的热点。

3.1 miRNA-141

1993年，Lee等[31]在线虫中发现首个miRNA-lin4。2000年，Reinhart等[32]在线虫中发现第二个miRNAle7。随后越来越多的小分子RNA被发现。miRNA-141属于miRNA-200家族，miRNAs的基因家族可以调节细胞运动，控制“干细胞”和细胞凋亡[33]。Xu等[34]研究结果表明，miRNA-141在骨肉瘤表达水平降低，过量表达miRNA-141不仅可以抑制骨肉瘤细胞增殖，还可以诱导细胞凋亡。miRNA-141是通过ZEB1或ZEB2抑制骨肉瘤的生长并诱导其凋亡。这一发现可以阐明miRNA-141在骨肉瘤中的作用机制，其表达量的高低与骨肉瘤患者的预后息息相关，引发研究者产生是否能针对该基因为骨肉瘤的治疗提供新的分子靶点的思考。

3.2 miRNA-152

miRNA-152是miRNA-148/152家族成员，参与一系列的细胞活动，包括细胞增殖、侵袭和血管生成[35]。miRNA-152的低表达与多种恶性肿瘤的远处转移和生存时间相关[36]。Wang等[37]对80例骨肉瘤患者、20例骨膜炎患者和20例正常人的标本进行研究，探讨miRNA-152表达情况与骨肉瘤的相关性。研究结果认为，miRNA-152低表达组生存时间短于miRNA-152高表达组，且差异有统计学意义（P＜0.001）。采用Cox回归分析分析miRNA-152在骨肉瘤预后预测中的应用价值，结果显示，低表达miRNA-152是骨肉瘤患者的不良预后的一项指标（P=0.004）。基于上述研究结果，临床医师可早期对骨肉瘤患者检测miRNA-152的表达量，从而对骨肉瘤患者的预后进行预测，并形成相应的早期治疗方案。

3.3 miRNA-221

miRNA-221在脊椎动物中是高度保守的，由人类的X染色体上编码[38]。迄今为止，许多研究已经探索了miRNA-221作为致癌miRNA或肿瘤抑制miRNA时在癌症发生中的作用。Zhu等[39]采用q-PCR、蛋白印迹、细胞转染等技术研究miRNA-221基因与骨肉瘤的相关性，结果表明，miRNA-221的下调显著增加了PTEN的表达，而上调的miRNA-221则显著降低了PTEN的表达，miRNA-221通过抑制PTEN增强骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。是否可以通过相关药物刺激miRNA-221表达量的增加来治疗骨肉瘤患者，这是一个值得探究的问题。

3.4 miRNA-382

miRNA-382是长度为18～22个核苷酸的非编码小RNA分子，通过与互补序列的相互作用，在转录后水平调控基因的表达[40]。Xu等[41]对所收集的骨肉瘤标本采用实时定量PCR、蛋白印迹、流式细胞技术和生存分析进行研究，论证了miRNA-382表达量在具有不良化疗反应的骨肉瘤患者标本中明显下降。此外，临床数据表明，降低的miRNA-382表达量与骨肉瘤患者不良生存情况相关。miRNA-382的过表达分别通过靶向KLF12和HIPK3抑制细胞的生长和耐药。相反，miRNA-382抑制表达或靶基因的过表达在体外和体内刺激了骨肉瘤细胞的生长和化学抗性。总之，这些发现提示miRNA-382是肿瘤抑制性miRNA的一种并且诱导miRNA-382的表达是一种潜在的抑制骨肉瘤进展的策略。

3.5 miRNA-451

近年来，在膀胱癌[42]、胃癌[43]及胶质瘤[44]中均有关于miRNA-451的报道研究，故相关学者就着手研究miRNA-451的表达量与骨肉瘤的相关性。Yuan等[45]通过q-PCR、流式细胞技术并建立动物模型研究miRNA-451对骨肉瘤发生发展的影响，认为骨肉瘤组织中miRNA-451的表达水平低于相应的非癌骨组织，且差异均有统计学意义（P＜0.001）。此外，miRNA-451表达水平在晚期骨肉瘤、远处转移性骨肉瘤、新辅助化疗疗效差的患者中明显降低（P=0.001、0.015、0.001）。这些发现提示miRNA-451不仅可以作为一种新的诊断和预后指标，而且可以作为骨肉瘤分子治疗的潜在靶点。

4 其他

4.1 迁移诱导基因7（migration inducing gene-7，MIG-7）

血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）是一种最近发现的不同于传统的肿瘤血管生成的血液供应系统。它的特点是其形成通过无内皮细胞的高侵袭性肿瘤细胞导液通道参与[46]，促进肿瘤新生血管的生成，从而促进肿瘤的生长、侵袭与转移。Ren等[46]通过实验研究表明了，MIG-7的表达独立显示了完全和无转移生存率的情况，MIG-7的体外敲低也大大减少骨肉瘤细胞中的迁移、侵袭和VM形成。MIG-7敲低也在原位小鼠中表现出有效的抗肿瘤、抗转移和抗VM效应。因此，可以认为MIG-7是骨肉瘤患者一个独立的不良预后指标，通过检测骨肉瘤患者MIG-7基因的表达量，从而对骨肉瘤患者的预后起到一定的预测作用，并且针对性的进行早期治疗。

4.2 细胞色素P-450（cytochrome P450，CYP）基因

CYP基因产物主要定位于细胞线粒体内膜与内质网中[47]，参与激素的合成与分解、胆固醇代谢、维生素D代谢，其基因的异常状态在肿瘤发生和治疗反应中起着重要的作用[48]。Alini Trujillo-Paolillo等[49]通过qRT-PCR技术和预后随访对135例骨肉瘤患者进行研究，结果表明，CYP基因的高表达在骨肉瘤的原发和转移及治疗反应中起重要作用，促使人们对CYP基因在骨肉瘤早期诊断及治疗中的作用的进一步思考。

5 小结与展望

综上所述，目前与骨肉瘤不良预后相关的基因主要可以归类为ErbB基因、癌基因、miRNA基因及其他四大类基因家族。这些基因的不良表达，不仅仅会引起肿瘤细胞侵袭性、转移性的增强，也会增强肿瘤细胞对于传统化疗药物的耐性。对于骨肉瘤患者治疗的研究目前正处于瓶颈期，现阶段对于骨肉瘤研究的主要目的在于探寻有价值的生物标志物，促进靶向药物研发，最终改善其疗效和预后。本文通过对目前与骨肉瘤不良预后相关的主要基因家族的系统阐述，激发学者对于骨肉瘤研究的进一步思考，以期为骨肉瘤的早期诊断与治疗提供新的方向，改善骨肉瘤患者的不良预后。