外泌体标志物和肿瘤液体活检的研究进展及现状

林宇晟 甘进锋 江钰琛 王飞寒 张灏

恶性肿瘤是世界公共卫生中还未攻克的主要难题，有效的治疗手段还非常有限。临床上对于肿瘤的诊断，通常依靠组织活检，需要非常专业的临床医生取材处理，操作难度大。液体活检作为一种全新的手段，在样本取材上明显不同，不仅可针对血液，也可以选取唾液、胸腔积液、尿液等体液。液体活检避免了手术开刀和穿刺对患者造成的伤害，在安全性上具有较大优越性，操作难度也明显较低，简便易行［1]。该技术对肿瘤诊断、治疗、预后等具有全程监控的作用，实时性和时效性较强。

目前液体活检领域的手段主要包括ctDNA、CTC、外泌体，以及细胞外游离核酸（RNA和DNA）［2-3]。外泌体是由胞吐作用释放到细胞外的纳米级细胞外脂质双层囊泡，直径为30～150 nm，几乎能被所有细胞类型在各种生理和病理条件下分泌到细胞外微环境［4-5]。外泌体携带的信息多种多样，因此外泌体分子作为各种类型肿瘤的生物标志物已成为肿瘤研究和转化的关注点。尽管外泌体的内容物和携带物也被不断地重新定义［6]，但是外泌体具有的优势和独特性，已经证明其作为肿瘤和其他疾病标志物的巨大潜力。

1 外泌体mRNA

信使RNA（mRNA）是一种携带遗传信息并且能够指导蛋白质合成的单链核糖核酸。肿瘤细胞分泌的外泌体中的mRNA携带了大量肿瘤细胞遗传信息，因此检测外泌体中特异性mRNA既可用于诊断肿瘤，评估肿瘤进展，也可用于监测治疗反应。已有报道证实血浆外泌体中PD-L1 mRNA的表达水平与黑色素瘤和非小细胞肺癌的PD-L1抗体免疫治疗反应相关［7]。该项研究证实了外泌体mRNA可作为一种可检测肿瘤免疫治疗且易获得的生物标志物，为临床的治疗方案选择提供指导。尿液中外泌体的mRNA与前列腺癌细胞具有相同的转录组，癌组织与相应患者尿液外泌体中CDH3的mRNA表达均下调［8]，因此尿液中外泌体的基因检测可作为一种非损伤性检测手段，代替活检鉴别前列腺癌及单纯前列腺特异性抗原（PSA）升高的疾病，提高临床诊断的准确性，有效减少不必要的损伤性治疗手段。在前列腺癌与外泌体的其他研究中，也有许多证据表明mRNA与癌症进展［9]或重塑肿瘤微环境有关［10]，揭示了外泌体mRNA在前列腺癌进展中发挥重要作用。一方面，癌细胞分泌的外泌体mRNA可通过提升原发灶肿瘤细胞恶性程度和“驯化”转移灶微环境促进肿瘤进展。另一方面，外泌体mRNA通过作用于靶癌细胞的相关基因而促进癌细胞耐药。另有研究报道，肺癌及胰腺癌患者血浆中外泌体hTERT的表达较健康对照组显著升高［11]，说明外泌体mRNA对肿瘤早期诊断具有重要意义。以上研究结果提示，外泌体中的特异性mRNA可以有效诊断肿瘤，评估肿瘤预后，甚至具有指导临床相关治疗及用药的潜在价值，值得进一步探索。

2 外泌体嵌合RNA

嵌合RNA，又称融合转录物，由2个或多个不同基因的外显子相互连接组成。嵌合RNA及其编码产物通常是导致肿瘤发生的原因之一［12]。肿瘤细胞外泌体通过携带嵌合RNA等功能性分子，以多种机制介导肿瘤进程。本课题组在嵌合RNA的研究中，通过高通量筛查首次发现了转录异常剪接产生的嵌合RNA（命名为GOLM1-NAA35）在肿瘤中异常表达。深入分析发现这种嵌合RNA可通过外泌体分泌到唾液中，进一步评估发现唾液外泌体GOLM1-NAA35水平可反映肿瘤生长状况，能作为非侵入性诊疗手段以及早筛和预后复发风险评估的生物分子，成为ESCC潜在的诊断及预后生物标志物［13]。我们认为外泌体嵌合RNA表达水平可反映肿瘤生长状况以及作为癌症风险评估的生物分子，相信该发现将为肿瘤生物标志物的研究提供重要推动力。外泌体嵌合RNA作为诊断标志物逐渐受到关注，其高特异性和敏感性为肿瘤早期诊断作出了巨大贡献，但是否能成为常用的临床诊断标志物的替代选择，仍需在大样本研究中进一步验证。

3 外泌体miRNA

miRNA是一种小的非编码RNA分子，包含大约22个核苷酸。外泌体中的miRNA在众多种类的RNA中含量最高，且因其不易被RNA酶降解而稳定存在。相较于其他生物小分子，由于miRNA易富集，取材简便等特点，成为目前外泌体研究中较多的一类生物小分子。miRNA作为生物标志物在多种癌症（包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌和前列腺癌等）的早筛、诊断和预后等方面的潜在应用价值已有大量报道。有研究显示microRNA-1246在侵袭性前列腺癌中可作为理想的诊断生物标志物［14]。血清外泌体miR-375和miR-1307可作为有效的卵巢癌诊断潜在生物标志物，联合传统的生物标志物CA125和HE4，可显著提高诊断的特异性和准确性［15]。还有研究指出血清外泌体中miRNA-638下调预示肝癌患者预后不良［16]；循环外泌体中 miRNA-125a-3p可作为早期结肠癌的诊断生物标志物［17]。还有研究发现外泌体miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c在肝母细胞瘤患者中表达显著降低，进一步分析发现外泌体中miRNA-34可作为肝母细胞瘤患者诊断和预后评估的生物标志物［18]。然而，这些研究提出的观点或验证的结果能否最终转化而应用于临床，仍需科研工作者和临床医生的更多努力和合作。

4 外泌体lncRNA

长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度超过200个核苷酸且缺乏完整的开放阅读框的不具有蛋白质编码功能的RNA。在外泌体lncRNA作为肿瘤生物标志物的相关研究中，有报道指出血清中分离得到的外泌体lncRNA HOTTIP可作为胃癌诊断的潜在生物标志物，较CEA、CA19-9等传统标志物具有更高的准确性，为胃癌提供了更具特异性的非侵入式诊断手段［19]。另外，在前列腺癌研究中发现，前列腺癌患者尿液外泌体lncRNA-p21的表达较前列腺增生患者上调，可作为不同时期前列腺癌的诊断分子标志物，有望用于临床指导不同阶段前列腺患者的个体化治疗［20]。尽管目前lncRNA作为肿瘤诊断或预后评估生物标志物的研究尚处于起步阶段，但外泌体中的lncRNA提取方便，在环境中能够稳定存在［21]，为进一步深入研究提供了有利条件。

5 外泌体circRNA

环状 RNA（circular RNAs，circRNA）是一类内源性非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA），区别于传统的线性RNA，circRNA由反向剪接形成，是一种共价闭合的单股环状分子。由于较高的保守性和稳定性，circRNA具有更大的潜力成为诊断肿瘤的理想生物标志物［22]。有证据表明胃癌组织中circR-002059显著下调，其表达水平与胃癌细胞转移、肿瘤TNM分期、性别和年龄等相关［23]。也有研究提出并验证了circPVT1在胃癌组织中表达上调，并且可通过“海绵吸附作用”调节miR-125家族成员而促进胃癌细胞增殖［24]，该研究认为circRNA可以作为miRNA海绵间接调控肿瘤的发生、发展，可作为潜在的肿瘤发生预测指标。

目前，circRNA已成为该领域研究的新热点，其在肿瘤诊断、治疗及预后评估中的潜在临床价值正受到密切关注。circRNA的丰富、稳定、保守、特异等特点，以及其反义互补序列和RNA结合蛋白（RBPs）可在circRNA的生物合成中产生重要的作用［25]，但大多数circRNA的降解和定位仍需进一步研究证实。circRNA在肿瘤发生发展中的作用及分子机制还有待进一步阐明，在检测和定性方法上仍存在局限性，不同的生物信息学方法或测序数据也会造成circRNA的识别出现偏差，因此其全长序列检测技术仍有待进一步发展。circRNA在肿瘤组织、血浆及唾液中的表达具有特异性，提示其在疾病诊断和治疗中具有较好的临床应用价值，有望成为肿瘤早期诊断、预后判断的分子标志物及肿瘤治疗靶点。

6 外泌体piRNA

外泌体中除了含有多种短链RNAs和长链RNAs，还发现其中含有病毒RNA、tRNA、小核RNA、circRNA、piRNA及ncRNA。小非编码RNA（sncRNA）包括miRNA和piRNA。在对外泌体来源的RNA进行研究时发现，与miRNA相比，piRNA大小不同（26-31 nt），缺乏序列保守性且复杂性有所增加［26]。参与piRNA生物合成的piRNA和蛋白质（例如PIWI家族蛋白）的失调已在多种肿瘤中被发现，包括乳腺癌［27]，突出了piRNA介导的表观遗传事件在人类体细胞癌变过程中的新兴作用。通过测序量化体液中提取的外泌体含量，发现与miRNA和mRNA相比，piRNA仅占了总量的极小一部分。目前piRNA与肿瘤的关系尚没有清晰的研究体系，还需更多证据验证外泌体源性的piRNA与肿瘤发展的关系。

7 外泌体蛋白

近年来，随着蛋白组学技术的普及，越来越多来自各种细胞培养基和体液（如血浆、尿液、胸腔积液、腹水、前列腺液、乳汁、乳头溢液等）的外泌体蛋白的组成和功能相继被揭示，其在预测肿瘤发生发展中的作用也越来越受到重视。

多项研究表明外泌体携带的蛋白质在不同肿瘤中存在差异性表达。有研究显示非小细胞肺癌患者的血清外泌体会呈递过表达的蛋白，其中NY-ESO-1、EGFR、PLAP、EpCam和Alix等过表达与较短的总生存期密切相关［28]。一项研究利用蛋白组学手段，从乳腺癌患者血浆外泌体中鉴定出144个高度磷酸化的蛋白，其中 3 个蛋白（RALGAPA2、PKG1、TJP2）在乳腺癌患者中的磷酸化水平更高，认为血液中外泌体磷酸化蛋白的组成可能为乳腺癌诊断和预后提供新的标志物［29]。最近，来自范德堡大学的研究者对外泌体的蛋白成分进行了重新定义，其将外泌体从其他类型的细胞外囊泡中分离出来，随后进行蛋白质组学和核酸分析，认为外泌体中并没有重要的miRNA加工蛋白Argonautes（Agos），以及其他具有RNA分选作用的RNA结合蛋白（RBPs），同时缺乏细胞骨架元素和常见的糖酵解酶，这表明外泌体的装载是一个高度调控的过程［6]，显示了外泌体结构和组成的独特性，这一结果有待今后更多的研究验证和评价。

以上研究结果说明来自体液的外泌体会选择性地富集癌症病变的特征性蛋白，针对这些蛋白的检测可能对疾病诊断有一定意义，但这些外泌体蛋白标志物在肿瘤诊断和治疗中的应用有待进一步验证。

8 外泌体DNA

相较外泌体中丰富的RNA含量，也有少数报道发现某些特殊来源的外泌体包含DNA分子，包括基因组DNA和线粒体DNA（mtDNA）［30-31]。外泌体中包含的DNA很大程度上与其来源肿瘤细胞中的DNA保持一致的状态，提示外泌体DNA可作为检测致癌性突变的有效生物标志物［32-34]。有研究［33]表明嗜铬细胞瘤（PCC）和副神经节瘤（PCL）患者的外泌体含有能反映易感基因突变状态的双链DNA（dsDNA），且几乎覆盖所有染色体，还指出外泌体dsDNA存在的明确证据，显示其可作为一种非侵入性生物标志物用于PCCs和PGLs的遗传诊断和术前评估，且是最有效的体细胞突变筛查手段之一。另外一项研究指出，外泌体可以储存完整的线粒体基因组，这些细胞外小泡反过来可以将它们的mtDNA转移到代谢受损的细胞，从而恢复代谢活动［35]。然而，也有研究不认为外泌体是细胞外DNA分泌的载体。来自范德堡大学的一项研究表明dsDNA和DNA结合组蛋白不存在于外泌体甚至其他类型的细胞外囊泡中，认为细胞外dsDNA和组蛋白的活跃分泌是通过自噬和多泡内体（MVEs）依赖的机制发生，而不依赖于外泌体［6]。可见外泌体中DNA的存在与否以及其来源和产生目前尚存争议，有待验证。

9 展望

相对于其他两种液体活检技术（ctDNA和CTC），外泌体在体液中浓度较高，有利于肿瘤的早期诊断；脂质膜结构对所含核酸分子起到良好的保护作用，具有较高的稳定性；信息量更大，包含了与来源肿瘤细胞相似的蛋白质及核酸，是一种可从多层面发现肿瘤特异的分子标志物［36]，但目前外泌体相关的肿瘤标志物还有待进一步发掘。

外泌体的结构和组成有其独特性，在机体内部具有良好的生物稳定性和生物相容性、低免疫原性和低毒性，用于生物标志物研究的潜力巨大［37]。在将来，对新型外泌体生物标志物的系统鉴定模式需要进一步开发。鉴于现今能用于指导临床的成熟外泌体生物标志物有限，大量临床信息如生存时间、复发状况和药物应答等十分紧缺，证实生物标志物在早期诊断、预后和用药中的作用，还需要更多的临床试验验证。此外，外泌体及其内容物的生物起源和作用机制尚存争议，对其进一步研究，有助于指导生物标志物的开发和药物设计，并最终反馈促进对机制的理解。

由于外泌体核酸分子提取和检测技术相对成熟，目前对外泌体标志物的研究主要集中在核酸分子。而外泌体蛋白质标志物的研究，对外泌体分离的质量要求极高，依照现阶段技术提取的外泌体蛋白质往往携带污染蛋白，且外泌体蛋白质丰度相对较低，难以检出其表达［38]。以上因素严重制约了外泌体蛋白质标志物研究的推进和临床转化。但是，随着蛋白质组学技术的飞速发展，将极大促进外泌体蛋白质标志物的研究，有望发现更多特异、灵敏的外泌体蛋白质标志物。外泌体及其内容物的提取、低丰度RNA、DNA或蛋白的放大，以及高效、高敏、高特异性的生物信息学分析方法，在未来的外泌体生物标志物发展中尚需不断调整、标准化和优化。外泌体技术的临床应用研究仍然面临诸多挑战，同时也伴随着诞生无数新发现和新技术的可能性，其在恶性肿瘤中的精准治疗应用已凸显巨大潜力，期待外泌体在肿瘤液体活检领域中的研究应用，能让患者获益更多。