面向生物打印的组织工程支架材料选配

武力，亓春伟，陈勇，李欣芯，冯铭龙，许龙贺

(大连交通大学 机械工程学院，辽宁 大连 116028)*

0 引言

三维打印技术(3D Printing)即快速成型技术，它以数字模型文件为基础，运用金属、陶瓷或高分子等材料，通过逐层打印的方式来构造结构体[1].目前，3D打印技术在医疗上的应用逐渐广泛，涉及到医学模型[2]、手术导板[3]、个性化化植入物[4]、生物组织支架[5]、体外细胞结构体[6]等等.组织工程是运用工程科学与生命科学的基本原理和技术，研究与开发生物替代物 ,从而恢复、维持和改进人体组织功能的一门新兴交叉学科[7].运用三维生物打印技术打印人体组织结构，构建体外细胞生长环境，对于药物研发、组织再生和器官移植具有积极推动作用.Tina Qing Huang等采用PEGDA/LAP/HMBS的混合材料通过3D打印技术制造仿生微观结构用于癌细胞移植[8].Falguni Pati等采用PCL材料，通过熔融沉积打印技术打印出细胞加载的支架结构[9].M. Enamul Hoque等采用PCL/PEG材料打印出组织细胞三维支架[10]. 本文以体外构建组织工程支架为目标，基于生物3D打印机，从选择材料开始，以析因试验为基础，选择出材料配比，为后期打印多孔支架，培养体外细胞结构体，进行个性化测试奠定基础.

1 生物打印机与打印

在选择材料配比的过程中，以德国envision TEC公司开发的3D-Biopiotter生物打印机的点胶针筒挤出材料长度作为评价材料配比的依据.其工作原理是通过挤压针头在三个维度上的移动，将处于流体、熔融、胶体和糊状的材料以连续线条或者单点方式沉积形成三维结构体.打印的材料涉及金属、陶瓷、高分子等，单一材料、混合材料或多种材料均可单独或者同时利用生物打印机进行打印，但必须制成能动性的流体.

生物材料(Biomaterials)是近年来快速发展的新兴学科，是材料学、生命科学、医学、工程学的交叉融合，被广泛应用于临床医学、新型制造、生物技术等领域[11].狭义上的生物材料是指生物医用材料(Biomedical Materials)，是一类用于诊断、治疗、修复或替换人体组织、器官或增进其功能的新型高技术材料.生物医用材料按材料的组成和性质可以分类如下：金属材料、生物陶瓷和高分子材料.对于金属和生物陶瓷材料，虽具有生物相容性，但是不具有生物降解性，因此不能作为组织工程支架的选材，而高分子材料同时具备生物相容性与生物降解性，所以从高分子材料中选择支架材料.通过筛选确定天然高分子材料明胶与海藻酸钠作为打印材料.明胶与海藻酸钠的相关特性介绍，见表1.

表1 明胶与海藻酸钠的特性

2 实验设计

2.1 设计试验

析因设计又称全因子实验设计，是将实验中涉及的全部实验因素的各水平全面组合形成不同的实验条件，每个实验条件进行两次或两次以上的独立重复实验[12].本试验涉及四个因素：明胶和海藻酸钠的用量、温度、压力，各因素有不同的水平，将全部因素的各水平组合成不同的试验进行，测量每一个试验下的挤出长度，现将各因素与各水平介绍如下，见表2.

表2 因素与水平明细

2.2 材料配制

明胶和海藻酸钠选用成都艾科，AR.配制过程如下：

(1)首先用电子称称量一定质量的明胶与海藻酸钠，然后用量筒量取一定量的去离子水，倒入烧杯中，用玻璃皿盖在烧杯口；

(2)用磁力加热搅拌器加热到一定温度，将明胶加入烧杯，停止加热，同时用磁力搅拌器开始搅拌，直至明胶全部溶解且形成均一溶液；

(3)最后加入海藻酸钠，一边加热一边搅拌，当温度升至一定温度后，停止加热，但是继续搅拌.

(4)隔一段时间加热一次，升至一定温度，如此反复几次，至最终配成均一混合溶液；

在析因试验中，不同配比的材料采用相同配置条件，避免配置溶液的各因素对后续试验造成影响，将配置成功的混合水溶液装入点胶管内，为进一步试验做准备.为了方便记录试验数据，对不同配比下的混合溶液进行编号，从下至上，从左到右，依次编号为1、2、3、……、16，如图1.

图1 不同浓度配比下的编号

2.3 数据收集

将配置成功的均一混合水溶液装入点胶针筒内，加装塞子，并排除针筒内的空气，旋拧上针头，加载在生物打印机的打印仓内，调节打印机的相关参数以及进行相关设置，为收集数据做准备.因为随着温度的降低，混合水溶液发生脱水与交联现象，所以对于同一配比浓度下的混合水溶液，将温度从30～25～20～15℃进行调节，进行相关试验.将同一温度下的混合水溶液，调节压力从40～80～120～160～200 kPa变化.将同一配比浓度下的混合水溶液，在一定时间内、不同温度、不同压力下的挤出长度记录在表格中.现将数据收集过程中出现的相关问题予以说明，在30℃保温的过程中，不同配比浓度的混合水溶液均在针头形成悬滴，则说明30℃混合溶液流动性较高，而且在30℃时，无法形成均匀的悬挂在针头上的一根线条，两个悬滴展示如图2.在25℃时，材料能够形成均匀的线条， 在20℃时， 有轻微弯曲现象，在15℃时，弯曲较重且毛刺现象明显，现将10g明胶与1.5 g海藻酸钠混合溶液， 不同温度的出丝展现出来，如图3.通过对不同温度下线条的变化可知，说明随着温度的降低，材料表现出不同特性.

(a)

(b)

(a) 25℃线条

(b) 20℃线条

(c) 15℃线条

2.4 数据处理与试验结果

对收集到的在不同浓度配比下，不同温度，不同压力下的挤出长度的数据进行处理，将所有数据分成四个不同温度下进行处理，以横轴为不同配比浓度，纵轴为挤出长度，绘制得到在不同温度下，不同压力条件下，不同配比浓度下的挤出长度，在30℃条件下，如图4所示，在25℃条件下，如图5所示，在20℃条件下，如图6所示，在15℃条件下，如图7所示.

从图4中可知，在30℃时，在不同浓度的混合水溶液中，即使在最小压力40 kPa的情况下，挤出长度最短为20 mm，挤出长度在实际打印中作为挤出速度的参考，对于挤出长度为20 mm来说，相应的挤出速度过大，则在30℃时，即使采用较小的压力，所有浓度溶液均无法进行打印操作.

图4 30℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度

从图5中可知，在Ⅰ区，挤出长度较大，在Ⅱ区中，压力为40 kPa的时候，基本上挤不出，而随着压力的增大，挤出长度剧增，在Ⅲ区，材料挤出长度相对趋于稳定，呈逐渐减小的趋势，而在Ⅳ区，挤出长度趋于零，从不同区挤出长度的变化可知，在Ⅲ区，则比较适合打印.

图5 25℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度

从图6中可知，在Ⅱ区，相对于图5中的Ⅱ区，材料挤出长度明显减小，说明混合水溶液的稳定性较差，在Ⅲ区中，除编号9材料挤出长度发生波动变化较大之外，其他配比浓度下则相对稳定，且挤出长度逐渐减小.

图6 20℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度

从图7中可知，在15℃时，在不同浓度的混合溶液中，当溶液粘稠度较低时，挤出长度较大，而其他情况下，挤出长度基本上为零，即无法挤出材料，则实际打印过程中无法进行打印，材料稳定性较差，通过查阅资料可知由于温度较低，混合水溶液会发生脱水与物理交联现象，因此，在15℃的条件下，并不是理想的打印温度.

图7 15℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度

由图4～图7可知以下结果：

(1)Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ区在相同压力与温度的条件下，随着海藻酸钠浓度的增加，挤出长度成变短趋势，即随着海藻酸钠浓度的增加，溶液粘稠度增加.

(2)编号从1-5-9-13，2-6-10-14，3-7-11-15，4-8-14-16变化时，在相同压力与温度条件下，随着明胶浓度的增加，挤出长度成变短趋势，即随着明胶浓度的增加，溶液粘稠度增加.

(3)编号从1-6-11-16变化时，可知在相同温度与压力条件下，随着同时增加明胶与海藻酸钠配比浓度，挤出长度变短的趋势.

(4)在相同浓度与温度的条件下，随着压力的增加，挤出长度呈现增长趋势；在相同浓度与压力的条件下，随着温度的降低，挤出长度呈现缩短趋势；在相同压力与温度的条件下，随着浓度的增加，挤出长度呈现缩短趋势.

从(1)(2)结果分析可知，挤出长度随着一种材料浓度发生变化的情况，从(3)可知，挤出长度随着两种材料浓度同时增加的变化情况.从(4)可知，在不同浓度、压力和温度的相互关系中，挤出长度变化趋势，从图4、图7可知，在30℃和15℃条件下，挤出长度的变化趋势，同时根据挤出长度的趋势知在30℃和15℃的条件下，不可进行相关打印试验.从图5、图6可知，在Ⅰ区中，挤出长度太长，无法进行打印，在Ⅳ区内，挤出长度几乎全部为零，也无法进行打印，在Ⅱ区，材料稳定性较差，挤出长度波动性较大，在Ⅲ区中，除编号9材料挤出长度发生波动变化较大之外，其他配比浓度下则相对稳定，逐渐趋于零，通过以上分析可知，则选择在25℃下，编号10作为打印最佳配比较好，依据相关压力，进一步进行相关参数优化，为打印相关结构体，进行细胞培养以及个性化检测奠定基础.

3 结论

采用明胶与褐藻酸钠作为生物打印材料，运用析因试验法进行了材料挤出性能试验，测量了16种不同配比溶液分别在15、20、25、30℃温度和40、80、120、160、200 kPa压强下的生物打印机点胶针头挤出长度，绘制了15℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度、20℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度、25℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度、30℃不同浓度溶液配比在不同压力下的挤出长度的四条曲线，以挤出材料性态和挤出长度为评价指标，分析得出在25℃，压力200 kPa的条件下，15 g明胶与1 g海藻酸钠配制的混合溶液的挤出长度适合打印，为进一步优化打印参数与打印相关结构体，进行细胞培养以及个性化检测奠定基础.