酵母双杂交法筛选组织蛋白酶B相互作用蛋白质

王道余， 赵胜娟， 刘 燕， 刘 淼， 冯利兴*

（1.复旦大学 生命科学学院，上海 200433；2.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；3.中国科学院上海药物研究所，上海 201203）

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。近年来对肿瘤转移机制的研究发现，肿瘤转移过程中有多个因素参与转移调控，是一个非常复杂的过程[1]。肝癌细胞的侵袭和转移是肝癌治疗失败和患者致死的主要原因，了解肝癌的转移机制是十分关键而又迫切的需求。

在肿瘤侵袭转移过程中，肿瘤细胞侵犯并穿过基底膜及细胞外基质所组成的屏障，而蛋白酶（Cathepsin）在其中扮演了一个重要的角色[2]。组织蛋白酶是具有降解正常细胞蛋白质功能的半胱氨酸蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族。目前在许多组织中鉴定出了超过12种不同的种类，其中组织蛋白酶B（Cathepsin B）尤为重要，它与肿瘤的侵袭和转移密切相关[3-4]。研究表明，在许多侵袭性肿瘤或已经发生转移的肿瘤中，组织蛋白酶B是过量表达的，尤其在恶性肿瘤的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）中更为明显[5-7]。组织蛋白酶B可以与胱蛋白（cystatins）以及膜联蛋白四聚物（S100A10）相互作用，通过蛋白质水解激活ECM元件，进一步降解ECM，肿瘤细胞可以更好的移动并穿过细胞外基质和血管壁进入血液循环，从而在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用[3，8]。目前，越来越多的文献指出，组织蛋白酶B可能是肿瘤治疗的一个有效靶点[3，9-11]，对其作用网络的研究显得尤为重要。

酵母双杂交系统是在真核细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用的一种非常有效的技术。该系统采用的酵母转录因子是特殊设计的，其DNA结构域和DNA激活域是分离的，分别将其与诱饵蛋白和靶蛋白连接在一起，只有当诱饵蛋白与靶蛋白发生相互作用时，DNA结构域和DNA激活域发生空间接近，转录因子调控区下游的报告基因才能激活表达，因此根据报告基因是否表达，可以判断诱饵蛋白与靶蛋白之间是否存在相互作用。通过筛选特定的表达文库来寻找与靶蛋白相互作用的蛋白质，对于制作大规模蛋白质互作网络图而言，酵母双杂交技术也是一个有力的工具[12]。在本研究中，我们采用人组织蛋白酶B作为诱饵蛋白，试图寻找其在肿瘤细胞中的直接相互作用蛋白。

1 材料与方法

1.1 质粒、载体和宿主菌

采用Clontech酵母双杂交系统。诱饵载体pGBKT7：购自Clontech公司；诱饵基因pGBKT7-CTSB：作者所在实验室制备保存；靶载体pGADT7：购自Clontech公司；靶基因pGADT7-HepG2-cDNA文库：作者所在实验室自制；宿主菌AH109酿酒酵母：购自Clontech公司；DH5α感受态：作者所在实验室自制保存。

1.2 培养基

大肠杆菌培养基（LB）：0.5 g/dL酵母提取物，1 g/dL 多聚蛋白胨；1 g/dL NaCl，pH 7.0。

酵母完全培养基（YPDA）：1 g/dL酵母提取物，2 g/dL蛋白胨，2 g/dL葡萄糖，0.02 g/dL腺嘌呤。

酵母缺陷型筛选培养基：参照Clontech公司的Yeast Protocols Handbook。

其中各种培养基分别以下列符号表示：SD-T：-trp；SD-TL：-trp，-leu；SD-TLH：-trp，-leu，-his；SDTLHA：-trp，-leu，-his，-ade。

1.3 诱饵质粒构建及转化酵母菌株

CTSB扩增：以pMD18T-CTSB质料为模板，运用CTSB特异性引物对其进行PCR扩增 （引物F：5'－AAGGCCATTACGGCCATGTGGC AGCTCTGGG CCTCC－3'；R：5'－CCGGCCGAGGCGGCCTTAGATCT TTTCCCAGTACTGATCGGTG－3'）。PCR反应条件：首先94℃预变性3 min；其次94℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。

PCR产物回收并酶切：酶切体系为SfiI 1 μL、10×buffer 2 μL、100×BSA 0.2 μL、PCR 产物 17 μL，在50℃混合孵育5 h。

目的片段回收后与载体连接：T4连接反应体系为 T4 1 μL，T4 buffer 1 μL，pGBK7/SfiI 2 μL，CTSB 5 μL 加水 1 μL 至总体积为 10 μL，16 ℃连接过夜。

重组载体鉴定：重组载体转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于卡那霉素阳性平板，37℃过夜培养。挑取10个单克隆过夜培养后提取质粒，经酶切及测序鉴定，确定读码框序列是否正确。

1.4 诱饵蛋白自我转录激活检测

自我转录激活检测采用PEG/LiAC转化法，将诱饵质粒pGBKT7-CTSB转入AH109酵母菌株。设pGBKT7-p53/pGADT7-largeT为阳性对照，pGBKT7-laminC/pGADT7-largeT为阴性对照。HIS3和ADE2的检测采用点板培养的方法，将转化子点板至SD-TLHA平板，30℃恒温培养4 d，观察其生长状态，同时检测诱饵蛋白对LacZ报告基因是否存在转录激活作用。如果转化诱饵质粒的酵母菌落在SD-TLHA平板上无法生长，同时也不会在LacZ检测中使底物X－Gal变蓝，表明无自激活，否则存在自激活。

1.5 酵母双杂交文库筛选

用含有正确pGBKT7-CTSB诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-HepG2-cDNA转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+5 mmol/L 3AT平板。

文库DNA转化方法：从SD-T平板挑取含有pGBKT7-CTSB诱饵质粒的AH109酵母转化子单菌落一个，接种于液体SD-T培养基50 mL，30℃、225 r/min振荡培养18 h。转接于YPDA液体500 mL， 使初始OD600为0.2，30℃、225 r/min振荡培养4~5 h，至OD600为0.6。离心收集菌体，室温下4 000 r/min离心5 min。用30 mL无菌水重悬菌体，混匀，离心收集菌体，室温下4 000 r/min离心5 min，弃上清液。用20 mL、0.1 mol/L LiAc重悬菌体，混匀，离心收集菌体，室温下4 000 r/min离心5 min，弃上清液。用10 mL 0.1 mol/L LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温下4 000 r/min离心5 min，弃上清液。向离心管中依次加入9.6 mL 50%PEG3350，1.44 mL 1 mol/L LiAc，300 μL ssDNA （10 mg/mL），25 μg 文库质粒DNA，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。30℃水浴孵育30 min，42℃水浴热激25 min，30℃水浴复苏1 h。离心收菌，室温下4 000 r/min离心5 min，弃上清液，用10 mL无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 μL培养物经梯度稀释后涂SD-TL平板3块，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH+5 mmol/L 3AT平板，每块 200 μL，共 50块。30 ℃恒温培养 3~4 d，观察转化结果，记录转化效率。根据效率平板的转化子数量，计算筛库效率。

为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第3天时，用绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7~14 d。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。至影印清除后继续培养7 d，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，共挑取到84个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2~3 d。将上述SD-TL缺陷型平板上长出的84个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒温培养3~4 d后观察结果。同时将84个初始阳性克隆用无菌水重悬后点于滤纸片上进行LacZ报告基因检测。

1.6 阳性克隆验证

对上述筛选的阳性克隆进行质粒提取，再次转化后进行抗性筛选和质粒抽提，然后分别与诱饵质粒共转酵母细胞AH109验证，再次阳性者提取提质粒进行测序鉴定。

1.7 生物信息学分析

将测序得到的序列信息，采用NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）对测序所得到的序列进行BLAST分析。

2 结果与讨论

2.1 诱饵质粒的构建

从上述每个连接体系转化平板上，随机挑取4个大肠杆菌转化子接种于带卡那抗性的液体LB培养基，于37℃、250 r/min振荡培养16 h（过夜）后，用质粒引物进行PCR扩增，见图1。对扩增得到阳性条带的克隆各选取两个（编号为1、2）进行质粒抽提（Axygen质粒小量抽提试剂盒）和测序，插入片段测序结果经比对确认正确。

2.2 诱饵蛋白自激活检测

对照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在SD-TLHA缺陷平板生长。pGBKT7-CTSB+pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，LacZ检测中结果也与阴性对照相同，因此不存在自激活。pGBKT7-CTSB诱饵克隆没有自激活作用，可用于进行文库筛选，见图2。

2.3 文库构建和筛选

使用一种独特的高质量的文库构建方法，以获得高质量的酵母双杂交文库。主要流程为：Trizol法RNA的提取，mRNA的分离，第一链cDNA的合成，全长mRNA的富集和第二链的合成，DSN均一化处理，cDNA长度分级，Gateway BP重组和电转化，质粒提取，Gateway LR重组到pGADT7载体和电转化，酵母双杂交文库质粒提取，就可以得到全长均一化的高质量酵母双杂交文库。

图2 自激活检测结果Fig.2 Result of self-activation

根据酵母转化效率平板的转化子数量，计算筛库效率，为9.4×105cfu/gDNA，转库效率达标，可以进行文库筛选，见图3。

图3 文库转化效率Fig.3 Efficiency of library transformation

然后从筛库平板上挑取84个单克隆，进行His、Ade和LacZ报告基因实验进一步筛选，因为只有能通过3个报告基因检测才可被判定与诱饵蛋白具有相互作用。在ADE2和HIS3报告基因的检测结果中，可以看到，阳性对照在SD-TL和SD-TLHA都能正常生长，而阴性对照由于不会激活ADE2和HIS3报告基因，在SD-TL可以正常生长，但在缺少His和Ade这两种氨基酸的SD-TLHA平板上不能生长。因此，在84个初始阳性克隆中，能在SDTLHA生长的是激活了His和Ade报告基因。本实验文库筛选得到的84个初始阳性克隆中共有15个能通过3个报告基因的检测，编号分别为：1、2、3、4、5、7、14、15、24、38、52、58、73、80、81，见图 4。

图4 阳性克隆His、Ade和LacZ报告基因检测Fig.4 Report gene analysis of positive clone

将这些阳性克隆提取质粒并转入大肠杆菌DH5a中，再次进行抗性筛选，从中再次提取质粒而获得文库质粒。最终获得15个克隆，质粒提取后进行测序分析。

2.4 生物信息学分析

将15个阳性克隆测序并BLAST分析，在GenBank数据库中发现对应7个不同的基因，编码7种已知的蛋白质，分别是：BCL2-associated athanogene 6 （BAG6）、filamin A，alpha（FLNA）、ras homolog family member G （RHOG）、metallothionein 2A （MT2A）、ZXD family zinc finger C（ZXDC）、DEP domain containing 7（DEPDC7）和 A kinase（PRKA）interacting protein 1（AKIP1）。

3 结语

在本研究中，我们发现CTSB可以和7个蛋白质发生直接结合，其中包括BAG6。BAG（Bcl-2 associated athanogene）家族是细胞凋亡调控蛋白质家族，是上世纪90年代初发现的。BAG是多功能蛋白质，能够和热激蛋白、信号分子、抗细胞凋亡蛋白Bcl-2、核激素受体等多种细胞成分发生作用，BAG6是BAG家族成员之一。BAG6同样参与了大量生理和病理进程，包括凋亡、抗原呈递和T细胞相应等，而且可以调节新生多肽链的质量控制[13]。此外，BAG6和Scythe、Bat3一起作为HSP70的协同伴侣分子，共同参与多种生物学进程，包括细胞应激和活力等[14]。通过TRC通路调节蛋白酶体的组装，BAG6可以影响蛋白酶体的作用[15]。BAG6还可以清除错误定位的蛋白质[16]。而CTSB与BAG6直接结合，可能是其发挥相应生物学功能的基础，有必要进一步研究其结合的方式以及具体参与了哪些进程。

细丝蛋白A（filamin A，FLNA）是非肌性肌动蛋白结合蛋白，相对分子质量约280 000，又名ABP-280。能结合多种细胞膜蛋白及信号蛋白，可以调控细胞骨架的重排和细胞形态。FLNA可以参与RalA诱导的丝状伪足[17]及Trio、PAK1诱导的包膜边缘波动[18-19]。FLNA可以与微丝相互作用形成细胞骨架，为细胞提供机械强度，并支持细胞形态改变，因而能促进肿瘤的转移。FLNA也可以通过其与小GTPase家族成员R-Ras作用促进细胞迁移[20]。

RHOG（ras homolog family member G）是 Rho蛋白质家族成员，通过与GDP结合或GTP结合来调节失活或激活状态，从而在信号级联中扮演分子开关的角色。Rho家族蛋白可以驱动actin骨架重排调节，调控细胞形状、粘附和运动。敲除RHOG可以显著抑制恶性胶质瘤细胞的的侵袭行为，而且抑制Rac1 的激活[21]。

人金属硫蛋白（Metallothionein，MT）相对分子质量约6 000 000～7 000 000，在哺乳类动物中已发现四个 MT 组分：MT-1、MT-2、MT-3 及 MT-4。 而MT-2A是MT-Ⅱ亚型中惟一具有生物学作用的蛋白质[22]。MT-2A具有抗辐射、重金属解毒、清除自由基、修复组织损伤、调节微量元素平衡及抗衰老等作用，还与细胞的增殖、凋亡及肿瘤耐药密切相关，而且大量的研究发现，肿瘤组织中MT-2A的高表达与肿瘤的恶性程度及浸润深度呈正相关[23]。

ZXDC属于ZXD转录因子家族成员，可以调节MHC基因家族的转录[24]。DEPDC7作为CARMA的相互作用分子，对于激活G蛋白欧联受体后特异性传输CBM复合物信号是很关键的[25]。此外，它还可以调节NF-kB信号的激活[25]。而AKIP1也可以调节NF-kB信号通路[26-27]，进一步还可以调节肿瘤的血管生成[28]。

研究发现，在侵袭性肿瘤中蛋白酶的活性会高表达，包括CTSB[29]。许多临床研究策略尝试采用抑制蛋白酶活性来控制蛋白酶介导的肿瘤细胞转移性渗透。考虑到CTSB对于肿瘤细胞的保护作用，目前针对CTSB的抑制剂进行了大量研究工作，发现抑制CTSB活性可以显著推迟肿瘤的生长[30]。我们通过酵母双杂交技术发现了CTSB直接相互作用的蛋白质，这些蛋白质对于了解CTSB作用网络非常重要，有利于开发新型CTSB抑制剂。近年来从中药中筛选到许多高效的抗肿瘤单体化合物，包含了大量新型抑制剂，将是一个巨大的宝藏，等待人们去进一步挖掘[31-32]。