5～8周龄农安籽鹅日粮氨基酸模型的研究

■高安崇 肖永仁 孙永峰 杨连玉*

（1.吉林大学农业实验基地，吉林长春130062；2.吉林省桦甸市畜牧业管理局，吉林桦甸132400；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）

理想氨基酸模型是一种氨基酸平衡的模型。所谓平衡是指模型中的氨基酸比例接近机体合成每一种特定蛋白质所需的氨基酸比例。因此，建立理想氨基酸模型有利于在配制动物日粮时，使其各种所需氨基酸的比例尽可能的接近动物机体之所需[1]。在玉米-豆粕型饲粮中，蛋氨酸和赖氨酸通常是鹅的第一和第二限制性氨基酸。所以依据蛋氨酸和赖氨酸的配比设计日粮氨基酸模型，可以在一定程度上接近鹅理想氨基酸模型，以满足鹅对氨基酸的需要。目前，设计理想氨基酸模型的方法有很多，但在国内仅史旭升等[2]通过对蛋氨酸和赖氨酸需要量的研究，设计出0～4周龄农安籽鹅饲粮氨基酸模型。本试验采用玉米-豆粕型饲粮，利用在饲料中添加不同水平蛋氨酸和赖氨酸，根据5～8周龄农安籽鹅生产性能及血液激素和肝脏IGF-Ⅰ表达量在不同组别之间的差异，设计出农安籽鹅日粮氨基酸模型。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用鹅选用同一批次、体重相近健康的5周龄农安籽鹅80只，随机分为4组，每组20只。从5周龄开始试验饲养至第8周，共28 d，每个重复分别取体型相近的6只鹅，进行试验。按照正规方法组织采样，采集鹅肝脏组织，保存于-80℃超低温冰箱。

1.2 日粮组成及试验设计

基础日粮配方参照NRC(1994)家鹅饲养标准配置试验日粮，日粮组成及主要营养水平见表1。选取赖氨酸和蛋氨酸两个因素，采用2×2二因子试验设计，饲料中蛋氨酸水平分别为0.35%、0.50%，赖氨酸水平分别为0.85%、0.75%，试验处理见表2。根据试验得出的最佳蛋氨酸和赖氨酸组合，参照中国饲料成分及营养价值表设计氨基酸模型。

1.3 血液激素检测

第8周龄每组取6只鹅断头采血，血清保存在-20℃。放射免疫法测定血清胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生长激素(GH)和胰岛素(INS)，所用试剂购自天津九鼎生物工程公司。

表1 日粮组成及营养水平

表2 试验方案设计（%）

1.4 生产性能指标测定

每日记录饲料消耗，每周末记录体重，计算料重比、平均日增重。

1.5 主要试剂和仪器

总RNA提取试剂TRIZOL、Taq酶、回收试剂盒、克隆载体试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，cDNA第一链合成试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司；荧光定量PCR仪（STEPONE PLUS型）购自ABI公司。

1.6 总RNA提取和cDNA合成

按Trizol试剂盒说明提取各组织总RNA。测定总RNA的浓度和纯度,用变性琼脂糖凝胶电泳确定总RNA完整性。组织中总RNA的cDNA合成按试剂盒说明操作。

1.7 引物及探针设计

鹅IGF-Ⅰ和beta-actin的引物根据NCBI上登录的鹅 IGF-Ⅰ序列（DQ662932）和 beta-actin序列(M26111)设计合成，序列分别见表3。探针和引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

表3 引物及探针

1.8 TaqMan荧光RT-PCR

TaqMan RT-PCR 25 μl体积体系如下：1 μl上游引物、1 μl下游引物、0.5 μl TaqMan探针、12.5 μl Realtime PCR Master Mix、2 μl cDNA、8 μl蒸馏水。反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性15 s；60℃退火1 min。

1.9 重组标准品质粒制备

1%琼脂糖电泳检测RT-PCR结果，回收电泳得到的片段，回收片段与pMD 18-T Vector载体连接，转化大肠杆菌DH5α，克隆过程参照TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒说明书。经质粒提取，做pcr鉴定后，获得阳性克隆送交华大中天生物技术有限公司测序。

1.10 重组质粒定量标准曲线的建立

图1 IGF-Ⅰ重组质粒的PCR扩增

测定阳性重组质粒的OD值,计算出拷贝数。将标准品重组质粒进行7个梯度，10倍系列稀释,以系列稀释的质粒为模板在实时荧光定量PCR仪上扩增。本试验采用双标准曲线的方法分析目的基因的相对表达差异。试验中每份样品所含的拷贝数都可通过Ct值与标准曲线比较而得到。试验结果采用相对荧光定量即目的基因copies/内参copies（F值）来表示，本试验以beta-actin基因为内参。

1.11 数据分析

用SPSS24.0统计软件的Anova过程对试验数据进行统计分析，采用Duncan's法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 阳性质粒的PCR扩增鉴定

阳性质粒的PCR扩增鉴定以IGF-Ⅰ基因重组质粒DNA作模板，用IGF-Ⅰ引物进行PCR扩增，结果分别可见为120 bp的条带（见图1）。以beta-actin基因重组质粒DNA作模板，用beta-actin引物进行PCR扩增，结果分别可见为80 bp的条带（见图2）。同时，两个基因阳性质粒的测序鉴定结果显示，插入片段序列与NCBI上公布的序列同源性为100%。

图2 beta-actin重组质粒的PCR扩增

2.2 标准曲线的建立

本试验成功构建了鹅IGF-ⅠcDNA和beta-actin cDNA的标准曲线，IGF-Ⅰ：y=-3.066x+20.004；betaactin：y=-3.213x+20.476，其中，y代表Ct值；x代表模板量的对数值。Ct值和起始模板copy数均具有较好的相关性（IGF-Ⅰ：R2=0.996、beta-actin：R2=0.995）。

2.3 生产性能指标(见表4)

由表4可知，不同蛋氨酸水平的日粮对鹅的平均末重、日增重、料重比均有显著影响（P＜0.05），当日粮蛋氨酸水平提高时，料重比降低，增重速度加快，平均末重0.5%蛋氨酸水平显著高于0.35%水平。不同赖氨酸水平的日粮对鹅平均末重和日增重的影响产生显著差异（P＜0.05），其中较高水平赖氨酸（0.85%）组鹅的平均末重和增重速度都显著高于较低水平赖氨酸（0.75%）组，对平均日采食量影响不显著（P＞0.05）。不同水平的蛋氨酸和赖氨酸之间的交互作用对平均末重、日增重、料重比均有显著影响（P＜0.05），对平均日采食量影响不显著（P＞0.05），当饲粮营养水平为3组时，平均末重和日增重最高，料重比最低。

表4 不同处理对鹅生产性能的影响

2.4 血清中激素水平（见表5）

表5 各处理组血清激素浓度

由表5可知，饲粮中不同蛋氨酸水平对血清中IGF-Ⅰ的浓度影响显著(P＜0.05)，0.5%蛋氨酸水平组血清中IGF-Ⅰ的浓度显著高于0.35%蛋氨酸水平组。不同赖氨酸水平对血清中IGF-Ⅰ的浓度影响显著(P＜0.05)，0.85%组血清中IGF-Ⅰ的浓度显著高于0.75%组。不同的蛋氨酸和赖氨酸水平对血清中GH和INS的浓度影响均不显著(P＞0.05)。不同水平的蛋氨酸和赖氨酸之间的交互作用对血清中IGF-Ⅰ的浓度影响显著(P＜0.05)，第3组的血清中IGF-Ⅰ、GH浓度最高。

2.5 肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量(见表6)

表6 不同处理对鹅肝脏IGF-I基因表达量的影响

从表6可以看出，饲粮中不同蛋氨酸水平对肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量有着显著的影响（P＜0.05），0.5%蛋氨酸水平组肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量显著高于0.35%蛋氨酸水平组。不同赖氨酸水平对肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量影响不显著（P＞0.05）。不同水平的蛋氨酸和赖氨酸之间的交互作用对鹅肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量具有极显著的影响（P＜0.01），3组和4组极显著高于1组（P＜0.01），显著高于2组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 不同蛋氨酸和赖氨酸水平及其交互作用对农安籽鹅生产性能的影响

蛋氨酸和赖氨酸作为鹅玉米-豆粕型日粮的第一和第二限制性氨基酸，如果摄入量不足，会降低鹅对其它氨基酸的利用率，进而对生产性能产生影响。前苏联建议4～8周龄鹅蛋氨酸需要量为0.45%，赖氨酸需要量为0.9%，澳大利亚建议4～8周龄鹅蛋氨酸的需要量为0.4%，赖氨酸需要量为0.95%，李文立等[3]在对育成期五龙鹅的研究中发现，蛋氨酸和赖氨酸最适宜饲粮水平为0.33%和0.7%。王志跃等[4]在对5～10周龄扬州鹅的理想氨基酸模型的研究中报道，5～10周龄扬州鹅蛋氨酸和赖氨酸占日粮的百分比应为0.36%和0.78%。本研究表明，当日粮蛋氨酸水平为0.5%时，平均末重和日增重显著提高，料重比显著降低；当日粮赖氨酸水平为0.85%时，平均末重和日增重显著提高。有研究中提到，日粮中适量添加蛋氨酸可以提高28～70 d吉林白鹅的生产性能，但随着蛋氨酸添加量的提高，生产性能会有先升后降的趋势，适宜的添加量应在0.43%～0.83%之间[5]，这与本试验结果相符，说明0.5%的蛋氨酸添加量较为适宜。在一定的范围内，适量提高饲粮赖氨酸水平，可有效提高公鸡的体重、日增重，降低料重比等[6]，梁远东[7]研究发现，5～8周龄仔鹅最佳饲粮赖氨酸添加量为0.85%，这与本研究结果一致。在本研究结果中，蛋氨酸和赖氨酸的交互作用对农安籽鹅平均末重、日增重和料重比有显著影响，理想的组合为3组（0.5%Met和0.85%Lys），与李文立等[3]提出的提高鹅生产性能最适宜的蛋氨酸水平为0.33%～0.43%，赖氨酸水平为0.7%～0.8%的结果稍有差异，可能与鹅品种和日龄有关。

3.2 不同蛋氨酸和赖氨酸水平及其交互作用对农安籽鹅血清中激素水平的影响

张永翠等[8]对肉兔的研究中发现，不同蛋氨酸饲料添加水平对血清中INS和GH的含量无显著影响，对IGF-Ⅰ含量影响显著，随着蛋氨酸添加水平的增高，呈现先高后低的趋势。有学者在对黑山羊的研究中发现，降低日粮赖氨酸添加水平，会使血清IGF-Ⅰ浓度比对照组低14%[9]。本试验结果与上诉研究结果基本相符，即提高日粮中蛋氨酸和赖氨酸水平，可使血清中IGF-Ⅰ的浓度增加，而GH和INS则不受影响。这也与史旭升等[2]的研究结果相一致。蛋氨酸和赖氨酸的交互作用对农安籽鹅血清中IGF-Ⅰ浓度有显著影响，其中试验组3组（0.5%Met和0.85%Lys）浓度最高。

3.3 不同蛋氨酸和赖氨酸水平及其交互作用对农安籽鹅肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量的影响

有研究表明，动物肝脏中IGF-ⅠmRNA表达量受到日粮蛋白质水平的影响[10-12]，Brameid等[13]认为，蛋白质对IGF-Ⅰ基因的表达主要以氨基酸的形式调控。在本试验中，提高蛋氨酸水平会使肝脏组织中IGF-ⅠmRNA表达量增加，但赖氨酸改变水平却不会对IGF-ⅠmRNA表达量产生显著变化，但随着赖氨酸水平的提高IGF-ⅠmRNA表达量会呈现下降的趋势。在杜希海等[5]的研究中，0.5%水平的蛋氨酸添加量组使70日龄吉林白鹅背部、胸部和腹部的IGF-ⅠmRNA表达量最高。与本试验结果基本相同。井文倩等[14]报道，随着赖氨酸饲料中添加量的提高，70～90日龄的肉兔肝脏中IGF-ⅠmRNA表达量呈现先升高后降低的趋势。从本试验中可以看出，若要5～8周龄农安籽鹅肝脏中IGF-ⅠmRNA表达量达到峰值，日粮中赖氨酸水平应不高于0.85%。

4 结论

根据试验结果，5～8周龄农安籽鹅最适宜生长发育的饲料蛋氨酸水平为0.50%，赖氨酸水平为0.85%，最适宜的蛋氨酸和赖氨酸组合为0.50%蛋氨酸＋0.85%赖氨酸。参照中国饲料成分及营养价值表设定日粮氨基酸模型为：赖氨酸100，蛋氨酸59，胱氨酸34，苏氨酸83，异亮氨酸83，亮氨酸 199，精氨酸129，缬氨酸98，组氨酸55，酪氨酸79，苯胺酸110，色氨酸13。