激光共聚焦显微镜对样品检测中的温度变化及不同固定方法的研究

肖忠新 赵媛媛*

随着我国高校办学条件的不断改善，高校拥有的大型仪器逐渐增多，其中包括激光扫描共聚焦显微镜精密大型仪器，该仪器设备可以对样品进行断层扫描和成像，无损伤地观察和分析细胞的三维空间结构，已广泛应用在细胞生物学、生理学、医学免疫学及药剂学等研究领域。使用激光扫描共聚焦显微镜检测，对样品具有严格要求。有研究指出，样品所处环境温度会影响样品荧光强度的观测[1-2]。为此，本研究采用4%多聚甲醛缓冲液和甲醇两种常规的固定剂，使用之后再加促渗透试剂TritonX-100，观察其对细胞核染色图像质量的影响，通过样品的温度改变和不同样本固定方法，分析其对激光共聚焦显微镜观测结果的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

使用Leica TCS SP5型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司公司)观测样品。植物铃兰(Convallaria)样片(德国Leica公司)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染液(英国Abcam公司)染料；多聚甲醛缓冲液(江苏凯基生物公司)；甲醇(分析纯，北京化工厂)。激光共聚焦皿[耐思(NEST)江苏无锡耐思生物科技有限公司。

1.2 检测样品

检测的样品为植物铃兰(Convallaria)样片，样片用Fast Green和Safranin两种染料染色，并使用了防淬灭剂。检测不同固定方法的样品为人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)。用含体积分数为10%的FBS高糖培养基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，含封片剂的DAPI复染液染料，4%的多聚甲醛缓冲液，甲醇，20 mm激光共聚焦皿(NEST)。

检测温度对共聚焦显微镜影响的样品为德国Leica公司提供的经过荧光染色的植物铃兰(Convallaria)样片，样片用Fast Green和Safranin两种染料染色，并使用了防淬灭剂。检测不同固定方法的样品为人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)， 在20 mm激光共聚焦皿中培养。样品依据处理方法的不同分为A组和B组，A组为甲醇处理组(3个皿)，B组为甲醛处理组(3个皿)，A组分别使用4%的多聚甲醛缓冲液，甲醇固定。B组在其固定后再加促渗透试剂TritonX-100处理。人正常肺上皮细胞均使用含封片剂的DAPI复染液对细胞核染色。

图1 常温下铃兰样品荧光强度的变化曲线图

1.3 检测方法

1.3.1 分子荧光强度的测定

使用TCS SP5型激光共聚焦显微镜检测植物铃兰(Convallaria)样片。物镜为63倍油镜，数值孔径值为1.4。利用561 nm激光器激发荧光，探测器在610～691 nm接收发射光。同一个铃兰样片在两种温度下进行测定：①在室温下测定；②在冰箱-20 ℃冷冻保存12 h，取出后立即用激光共聚焦显微镜观测样片荧光强度的变化，随着时间的增加，铃兰样品温度逐步升高。采集铃兰样片图像时间均为间隔5 min采集1次，在同一个视野中连续采集图像7次，总共采集30 min。室温下和-20 ℃冷冻保存的铃兰样片是在相同的扫描参数情况下，使用激光共聚焦显微镜观测、采集图像。分析图像荧光强度是用莱卡公司LAS AF Lite软件，计算每幅图像中的平均荧光强度。

1.3.2 人正常肺上皮细胞固定方法的测定

(1)样本固定。人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)复苏后传代3代后用于实验，分为A组和B组，A组采用甲醇处理(3个皿)；B组采用甲醛处理(3个皿)。吸净培养基，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗1次，马上加入细胞固定剂。①A组甲醇处理(3个皿)方法：置于-20 ℃预冷的甲醇固定10 min，其中两个皿仅加PBS，不加TritonX-100，另一个皿加0.3% TritonX-100作用15 min；②B组甲醛处理(3个皿)方法：使用新鲜配置的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min，吸出甲醛，其中两个皿仅加PBS，不加TritonX-100，另一个皿加0.3%TritonX-100孵育15 min。

(2)细胞核染色。用封片剂含DAPI的染料染色10 min后，使用PBS清洗3次，每次5 min，然后每个皿再加入适量PBS。

(3)染色情况。使用TCS SP5型激光共聚焦显微镜观察DAPI染色情况，各皿所使用物镜均为63倍油镜，数值孔径值为1.4。采集荧光和明场图像，单个细胞的图像放大4倍拍摄。使用405 nm激光器激发DAPI染料，各皿的扫描参数固定不变。

2 实验结果

2.1 温度对荧光分子荧光强度的影响

(1)在常温下铃兰样品荧光强度的变化很小，曲线接近一条水平直线(如图1所示)。

(2)随着时间的增加，铃兰样品温度增高，逐步达到室温(23℃±1℃)时，平均荧光强度逐渐增强。在接近室温时，曲线上升趋势渐弱，曲线趋于平缓(如图2所示)。

图2 -20℃冷冻保存恢复到室温下铃兰样品荧光强度的变化曲线图

2.2 不同固定方法对细胞核染色的影响

采用4%多聚甲醛缓冲液和甲醇两种固定剂固定后，用DAPI对胞核染色的效果均不如加入促渗透试剂TritonX-100对核染色效果好，加入促渗透试剂后，核染色更均匀，且更坚实、清晰(如图3所示)。

图3 不同固定方法对细胞核染色的影响示图

3 讨论

按照常规，荧光物质的荧光强度在低温时比高温时要高，而样品加封片剂后，需考虑封片剂对荧光强度的影响。有研究指出，保存荧光样品的丙三醇含量会影响对生物介质中不同发射波长荧光分子的荧光强度[3]。

本实验研究结果显示，冷冻保存的荧光样品温度逐步达到室温时，荧光强度会逐渐增强，这与本研究偶尔遇到刚从冰箱冷冻保存的样品取出来，着急使用共聚焦显微镜检测荧光强度的结果相似。有研究表明，黏度增加使得荧光光强增加[4-7]。Kee等[8]的研究也提示荧光量子产率随黏度的增加而增大。样品荧光强度逐渐增强可能的原因是随着温度的升高，样片中的封片液逐渐解冻，处于低温下的封片液比常温下的黏度大，从而导致荧光发射强度增强。

固定剂影响样品观测已有报道，范瑾瑾等[9]的研究提示，对细胞支架成分的固定适用于有机溶剂固定剂，交联剂固定剂适用于膜相关成分的固定；张丽丽等[10]的实验表明，95%乙醇或甲醇作为固定剂固定细胞后，易导致荧光猝灭；而丙酮或4%多聚甲醛固定细胞后，对质粒荧光强度没有显著影响。本研究结果表明，样品使用交联型固定剂4%多聚甲醛或凝固型固定剂甲醇固定以后，如果再继续加入促渗透试剂TritonX-100，可以使细胞核的通透性增加，便于DAIP与核酸更好地结合，细胞核染色效果更清晰。

4 结语

荧光样本所处环境温度的改变会引起荧光强度的变化，在做荧光强度比较的实验时尤其要注意，应在室温下，同一个温度条件进行检测。从冰箱冷冻保存取出的样本应在室温下放置30 min以后，再使用激光共聚焦显微镜进行荧光强度测试。样品在一般固定剂固定以后，再加入促渗透试剂可以使细胞的通透性增加，染色更加清晰。在使用激光共聚焦显微镜时，如果不注意温度的改变和固定方法，将影响观测结果。