小干扰RNA技术治疗自身免疫性疾病应用展望

宋国婧 王永福

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解过程中沉默致病基因或蛋白片段表达的技术。运用RNAi干扰技术，可在细胞基因转录后抑制基因表达，来达到沉默基因的效果[1]，在遗传性疾病、肿瘤和自身免疫性等疾病的治疗中已广泛应用该项技术[2-3]。自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是指人体对自身抗原产生免疫应答致使自身组织器官受损而引起的疾病，主要包括类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征(Sjogren's syndrome，SS)、系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)等，临床上表现为产生自身抗体和免疫调节异常[4]。小干扰RNA(small interfering，RNA，siRNA)具有带负电荷、相对分子质量大和不稳定的理化特性，在体内易被降解且不易穿过细胞膜，需要与合适的载体相结合才能被运送至靶细胞。目前，常采用的载体递送方式分为病毒载体递送和非病毒载体递送两大类[5]。

1 siRNA在自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)研究中的应用

AID的发病机制为过度免疫应答产生的大量免疫细胞和免疫球蛋白堆积于正常组织，并损伤正常组织，使之发生病变和功能障碍。RNAi技术应用于AID，可以使相关疾病的致病基因或蛋白沉默，从而达到缓解或治疗AID的目的，并深入了解其发病机制，提出新的治疗靶点[6]。

1.1 siRNA在RA治疗中的应用 RA是一种病因未明的、慢性、以炎性滑膜炎为特征的全身性AID，临床表现多为慢性、对称性、以手足小关节为主的多关节炎症和关节外病变，其确切病因还未完全阐明。Liu S等[7]研究发现，在RA患者的外周T淋巴细胞中可观察到钙存储异常，细胞内钙信号传导通路参与多种免疫反应。因此，假设钙通过释放激活钙(CRAC)通道孔而形成的亚单位(CRACM1)进入细胞内，进而参与RA的发生过程。因此利用慢病毒载体将小鼠CRACM1 siRNA递送至患有胶原蛋白诱导关节炎(CIA)小鼠的局部关节和引流淋巴结(DLN)，从而沉默CRACM1的表达。结果发现，滑膜细胞中的钙流入下降、CIA组织病理学改变减轻，以及关节中炎性细胞因子，如IL-6、IL-17A 和IFN-γ的水平降低。另外，CRACM1-shRNA在体外以及CIA关节中可减少骨髓来源的破骨细胞数量，这与血清和关节中的RANKL水平降低有关。总之，通过沉默CRACM1的表达，可以抑制钙流入，减缓关节炎的发展进程，并且有可能成为治疗RA的新方法。Lee SJ等[8]研究发现RA发病机制中涉及到的各种促炎性细胞因子中，肿瘤坏死因子(TNF)-α在其他细胞因子的释放和慢性炎症的诱导过程中均起到关键作用。siRNA在体内生理环境中的稳定性较差，很难被递送至靶细胞。因此采用了一种聚合靶向TNF-α siRNA的纳米复合物(poly-siRNA)来治疗RA。5周后，与甲氨蝶呤(5 mg/kg)治疗组相比，静脉内注射psi-tGC-NP能够显著抑制CIA小鼠的炎症，并减少骨侵蚀，降低血清TNF-α含量。Sun Z等[9]发现siRNA1和siRNAc分别是IL-1β和TNF-α最有效的干扰序列，siRNA1 和siRNAc共转染后，IL-1β和TNF-α的表达在mRNA和蛋白水平上均受到抑制，同时细胞增生、集落形成和迁移能力降低，炎性因子减少。Song J等[10]运用PDAPEI/pDNA递送siRNA，从而降低膝关节滑液TNF-α的表达，减轻临床症状。有学者研究发现与对照组相比，沉默Sp1会导致成纤维细胞样滑膜细胞中TNF-α生成明显减少，从而减轻关节炎症状[11]。Wang H等[12]研究表明，与对照组小鼠相比，CARD11siRNA沉默组中CIA小鼠T辅助细胞17型(Th17)应答和促炎细胞因子的水平均有降低，炎症反应减弱。Zhang T等[13]发现静脉注射IL-15R siRNA能够减缓关节炎大鼠疾病的发展进程，缓解临床和影像学的症状表现。Lin HC等[14]研究证实，用siRNA沉默5-LOX可以降低TNF-α诱导的血清MCP-1水平，并减轻小鼠足跖肿胀现象，表明5-LOX抑制剂可以用于治疗炎症性关节炎。马莎等[15]研究证明沉默survivin基因的表达，可使RA患者滑膜成纤维细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平显著降低，滑膜成纤维细胞增生能力显著下降，说明靶向siRNA通过下调survivin的表达水平，可以减轻RA患者的症状，并改善其生活质量。丁爽等[16]研究发现使用RNAi技术沉默结缔组织生长因子(CTGF)的表达，观察其对RA患者成纤维样滑膜细胞(FLS)凋亡的影响，证实成纤维样滑膜细胞的增生凋亡失衡在RA患者滑膜病变中发挥主要作用。沉默FLS中CTGF基因的表达后，FLS凋亡显著增加，而survivin基因表达明显下降。因此推断出，CTGF减少RA患者成纤维样滑膜细胞凋亡的作用很可能是通过维持survivin基因表达实现的，可以通过抑制survivin基因的表达来延缓RA疾病的进展。靶向特异性细胞因子的疗法预示着RA治疗新时代的到来。

1.2 siRNA在SLE治疗中的应用 SLE是一种累及多系统、多器官并能够产生多种自身抗体和免疫复合物的AID。SLE患者临床上常表现为皮肤、关节、浆膜、心脏、肾脏、中枢神经系统和血液系统的损伤，而免疫系统功能的紊乱主要由T淋巴细胞减少、T细胞抑制功能降低和B细胞过度增生引起。但到目前为止，确切的病因尚不十分清楚[17]。Wang ZH等[18]研究发现CD40-siRNA可以降低血清中IL-17、IFN-γ和抗dsDNA抗体的浓度，同时可以提高IL-4的浓度。而当抑制CD40 mRNA和蛋白的表达后，可降低小鼠的炎症反应和疾病活动性，由此可见CD40-siRNA对SLE具有治疗作用。Li M等[19]通过全基因组分析表明，白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)与SLE在人类中的易感性相关。研究发现，IRAK1在B6.MRL-Faslpr/Nju(B6.lpr)小鼠和SLE患者的外周血单核细胞(PBMC)和脾细胞中过表达。用IRAK1小分子抑制剂(IRAK1/4抑制剂或IRAK-Inh)于腹膜内治疗后，可以明显减轻B6.lpr小鼠的炎症反应和肾损伤。IRAK-Inh siRNA可降低SLE 患者PBMC中NF-κBp65 的磷酸化水平，从而降低炎症反应程度。因此推测，IRAK1可以成为SLE和TLR-7诱导的SLE患者免疫细胞中IRAK-1和IRF-7的活化，可延长MRL/lpr其他炎性疾病抗炎治疗的潜在靶点。Wei S等[20]发现SLE患者Pin1及其下游靶点IRAK-1和IRF-7异常激活。此外，使用Pin1 shRNA抑制Pin1的表达，并阻断和B6.lpr小鼠的总体生存期。Pin1靶向治疗为SLE提供了一个新的治疗方向。Lennard Richard ML等[21]研究证明，Fli-1是Ets的家族成员，在SLE的发病机制中起到一定作用。CCL5是一种炎性细胞因子，可募集白细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞等免疫细胞到达炎症部位，并参与介导多种免疫性疾病，包括哮喘、RA和SLE。用FLi-1特异性siRNA转染内皮细胞，可使肾脏中炎症趋化因子CCL-5 mRNA的表达降低，并抑制内皮细胞中CCL5蛋白的表达。Ets1是Fli-1的启动子，可激活CCL5的负性调节转录因子，减少肾脏中炎症细胞的浸润，并延长患者生存期。Ripoll E等[22]研究发现，腹腔内注射Chol-siRNA后，小鼠肾组织中CD40 mRNA表达受到抑制，显著降低了初始CD3+T细胞和浆细胞的浸润，以及IgG和C3在肾小球的沉积，从而减轻肾脏的炎症反应。Nagpal K等[23]研究发现PP2A是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在SLE的病理学中起重要作用。Ikaros与PP2A的内含子位点结合，通过募集组蛋白脱乙酰酶HDAC1，来抑制PP2A的表达。用Ikaros siRNA沉默PP2A的表达，为治疗SLE提供了新思路。

1.3 siRNA在SS治疗中的应用 SS是一种以淋巴细胞浸润和特异性自身抗体产生(抗SSA/SSB)为特征，累及泪腺、唾液腺等外分泌腺体，进而出现多系统损害的慢性AID，临床上多表现为口干和眼干。Li Q等[24]构建鞘氨醇1- 磷酸受体-1(S1P1)siRNA慢病毒载体并感染人唾液腺细胞(HSG)，观察其对SS的可能疗法。结果显示，S1P1 siRNA可稳定转染HSG细胞，并有效的特异性抑制S1P1基因的表达，同时降低炎症细胞因子的表达水平，发挥治疗作用。Pauley KM等[25]利用靶向半胱天冬酶-3(caspase-3)的siRNA沉默caspase-3的表达，研究其是否可以阻止细胞因子诱导的HSG细胞凋亡。该项研究使用碳酰胆碱(一种毒蕈碱受体特异性配体)作为促分泌素，与靶向半胱天蛋白酶3的siRNA结合，并将其递送至细胞。结果发现，这种促分泌siRNA可以降低HSG细胞中的caspase-3 mRNA和蛋白的表达，并抑制唾液腺上皮细胞中细胞因子诱导的细胞凋亡，这对于改善SS的临床症状至关重要。Ectodysplasin-A2(EDA-A2)是与外胚层发育不良受体(XEDAR)结合的肿瘤坏死因子的超家族成员之一，Sisto M等[26]在原发性干燥综合征(pSS)患者的唾液腺上皮细胞(SGEC)中EDA-A2的表达和生物学活性的研究中发现，与健康对照组相比，EDA-A2及其受体、XEDAR mRNA 和蛋白质在pSS SGEC中过表达，EDA- A2/XEDAR通过胱天蛋白酶-3的介导参与细胞凋亡，表明EDA-A2/XEDAR 系统可能成为pSS基因治疗的新靶点。庞春艳等[27]研究α-胞衬蛋白(α-Fodrin)特异性siRNA对SS动物模型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平的影响，探讨α-Fodrin siRNA治疗NOD的可能性。将成功构建的α-Fodrin siRNA经尾静脉注射NOD小鼠，其中对照组和空载体组小鼠分别注射同等剂量的PBS和空载体。注射1、3、5、7 d后，分别对各组小鼠进行尾静脉采血，检测4组小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平，以及肺脏组织中α-Fodrin mRNA的表达水平。结果显示，在NOD小鼠中注射α-Fodrin siRNA后，血清中IL-4的水平升高、IFN-γ/IL-4的比值降低，同时α-Fodrin mRNA表达水平和α-Fodrin表达水平下降，提示α-Fodrin siRNA可以通过减轻NOD小鼠炎症反应，并延缓SS病情。

1.4 siRNA在SSc 治疗中的应用 SSc 也称硬皮病，是一种以局限或弥漫性皮肤增厚和纤维化为主要特征的AID，病变可表现为皮肤纤维组织增生和血管洋葱皮样变化，但至今病因不明。Evans IC等[28]利用c8orf4 siRNA下调特发性肺纤维化(IPF)和SSc患者成纤维细胞中COX-2的表达水平，并减少COX-2派生的PGE2合成，从而减轻肺纤维化的症状。Morry J等[29]表明NADPH氧化酶4(NOX4)和热休克蛋白47(HSP47)可以诱导胶原过度合成，进而导致纤维化。因此，将有效的靶向HSP47 siRNA递送至细胞后，可使HSP47蛋白在皮肤中的表达降低至正常水平。在SSc患者真皮组织纤维化的病变中，可以观察到TGF-β的含量升高，而siHSP47可以降低TGF-β的表达，同时可以使皮肤真皮层较之前变薄，并缓解皮肤纤维化症状，减少小鼠的皮肤厚度。Liu T等[30]研究发现PDGFR-α 在SSc成纤维细胞中过度表达并结合PDGF-AA，可以促进成纤维细胞转化。PDGFR-αsiRNA可以特异性下调PDGFR-α的表达，而阻断其与PDGF-AA的结合后，可以抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。

2 RNAi的治疗前景

将靶向siRNA递送至细胞内，使其沉默基因和蛋白的表达，可以缓解疾病症状并改善预后。因此，应用该项技术治疗AID成为目前最有前景的治疗方向之一。虽然近些年来，人们对于RNAi的研究有很大进步，但是仍然存在很多不足。同时，越来越多的疾病利用生物药物进行临床治疗，并且这类药物可以应用于常规治疗无效的疾病。siRNA属于生物药物的一种，虽然临床上已经接受了siRNA药物，但是它在传递、纯化、修饰、稳定性和免疫激活等方面仍存在很多不足。例如，裸siRNA是带有较强负电性的高度亲水性大分子物质，若直接导入机体，则很难穿透细胞膜并作用于靶细胞，而且siRNA在体内具有不稳定、半衰期短、细胞靶向性差和生物利用度低等特点[31]。另外，由于血清和细胞中存在核糖核酸酶，因此siRNA在血液、组织和细胞质中容易被酶类降解。并且在此种环境中，siRNA容易被化学修饰，而这些修饰作用可以改变其分子性质。尽管许多反义寡核苷酸药物可以被注射至血液，并被传递至某些组织中，但是它们不会通过血脑屏障，也不能进入心脏和肌肉组织。因此，目前RNAi技术的应用仅局限于真核细胞[32]，而这些亟待解决的问题则成为当前研究的热点，并且仍需要大量的研究来完善siRNA在AID中的应用。