闰盘蛋白在心律失常中的研究

陈奕帆 李学文

闰盘作为一个复杂的蛋白网，参与心肌肥大、心肌纤维化、心肌重构和心肌传导等多种病理生理过程。研究表明，闰盘连接成分的突变和缺失常常引起闰盘结构的紊乱和致死性心肌损伤[1]。在心肌细胞的多种病理状态下，闰盘蛋白的改变及不同闰盘蛋白之间的相互作用与心律失常的发生息息相关。现就闰盘蛋白及其相互作用与心律失常的关系进行综述。

1 闰盘蛋白

闰盘包括三种主要结构：桥粒连接、黏着连接(AJs)和缝隙连接(GJs)[2]。其中桥粒连接主要参与细胞的锚定支撑，黏着连接主要参与细胞的支架黏附作用，缝隙连接主要参与细胞之间信号转导和物质交换作用。

桥粒连接包含两个部分，在细胞间的部分由跨膜蛋白构成，包括桥粒芯蛋白(DSG)和桥粒胶蛋白(DSC)，它们使得桥粒对细胞骨架的支撑作用较黏着连接更强。附着于跨膜蛋白上的部分为黏附蛋白，其主要包括斑珠蛋白(PKG)、桥粒斑蛋白(DSP)和新斑蛋白-2(PKP2)，它们平衡细胞间的收缩压力和摩擦力，避免细胞损伤，并把肌间线蛋白连接到桥粒上。

黏着连接是肌原纤维的锚定点，可传导细胞间的机械力[3]。黏着连接主要包括斑珠蛋白、连锁蛋白(a-连锁蛋白、β-连锁蛋白、P-120)、黏着斑蛋白(Vcl)、a-辅肌动蛋白(a-actinin)。其中a-连锁蛋白与肌原纤维肌球蛋白的微丝相连，通过β-连锁蛋白和P-120再与胞外N-钙黏蛋白部分相连。黏着斑蛋白是细胞基质和细胞间与肌动蛋白结合的膜蛋白，除了把β-连锁蛋白连接到肌动蛋白上，a-连锁蛋白还锚定和组装肌动蛋白骨架到细胞膜上[4]。

缝隙连接是包含细胞间通道的特殊膜区域，它包括多种缝隙蛋白(CX)及相关连接蛋白如紧密连接蛋白1(ZO-1)、N-钙黏蛋白、周围连接等[5]。缝隙连接主要由12个连接蛋白组成的两个六聚体在细胞间相互对接形成。在心肌细胞中CX43是缝隙连接的主要成分，不仅存在于细胞膜表面也存在于线粒体中，参与心肌细胞间<1 000Da小分子(如离子、氨基酸、核苷、代谢分子、第二信使)的运输、电偶联以及信号转导[6]。周围连接主要位于神经元闰盘上，它与CX43相邻并列于基膜上参与神经元间的接触传导，具有延展性和离子通透性[7]。在心房传导阻滞中，周围连接的延伸和宽度与心律失常的严重程度密切相关。N-钙黏蛋白是单独跨膜的钙依赖性黏附蛋白，通过把CX43锚定到闰盘上参与闰盘通道的形成[8]。

此外，与闰盘相关的其他重要结构还包括离子通道、锚蛋白-G(Ank-G)等。闰盘中的离子通道主要分三类：电压门控钾通道(Kv通道)、ATP依耐性钾通道(Kir通道)、电压门控钠通道(Nav通道 )。心脏中的钠通道包括Nav1.3、Nav1.5，其中Nav1.5(电压门控钠通道)在动作电位快速上升期起重要作用。锚蛋白包括锚蛋白-G和锚蛋白-B，锚蛋白-B主要存在于T管中，而锚蛋白-G主要存在于闰盘中。

2 闰盘蛋白与心律失常

2.1桥粒连接

研究表明，约有一半的致右室心律失常疾病有桥粒黏附蛋白的基因突变,包括斑珠蛋白、新斑蛋白-2的基因突变。致心律失常右室心肌病(ARVC)特征是右室游离壁中纤维细胞和脂肪细胞替代心肌细胞并频发致命性心律失常甚至发生心源性猝死。参与ARVC发生的桥粒突变基因包括PKP2、DSP、DSG2、DSC2、PKG等[9]。有研究报道，常染色体隐形遗传性ARVC中Carvajar综合征和Naxos综合征分别与桥粒斑蛋白基因缺失和斑珠蛋白基因JUP的缺失有关[10]。Mazurek等[11]发现经MHC-miR130a转染的小鼠在出现心室功能异常之前即出现CX43和桥粒胶蛋白-2(DSC2)的表达下降，这表明DSC2减少在增加心肌的纤维化和脂质沉积并促发右室扩张和室性心律失常中发挥作用。另外，桥粒与黏着连接共同维持细胞的机械性支撑和心肌完整性作用。实验发现，当新斑蛋白2表达下降时也会降低缝隙连接的表达，改变心肌钠电流的幅度和动能，从而在解剖学异常处形成涡流、波裂和回旋，并最终引发折返性冲动[12]。Chen等[13]研究发现，6名ARVC伴有室性心动过速患者中有4名出现细胞桥粒斑蛋白基因的突变并伴有CX43的重塑，其中PKP2和DSP基因突变会破坏膜的转运和下调CX43的表达。李丹丹等[14]构建DSC2沉默的P19细胞株并分化为心肌样细胞，其纤维化和脂肪化相关基因表达显著升高，并具有与ARVC患者病理和分子生物学特点相似的表性特征。

2.2黏着连接

黏着连接大多通过与其他蛋白的相互作用参与心律失常的发生。黏着斑蛋白与ZO-1的直接作用并通过ZO-1与CX43氨基酸结合定位于缝隙连接上。而CX43的分布，表达程度，磷酸化水平与心律失常密切相关。Alice等[15]的动物实验中，将幼鼠心肌细胞的黏着斑蛋白基因敲除后，ZO-1和CX43的表达下降同时伴有心肌细胞凋亡。Swope等[16]实验中发现当特异性敲除小鼠心脏组织的斑珠蛋白不出现明显的传导异常反而表现出生存率的延长。当同时敲除β-连锁蛋白和斑珠蛋白的基因后老鼠表现为黏着蛋白的缺失所致的闰盘结构分散、心肌病、心肌纤维组织替代，并最终出现传导异常甚至心脏骤停。

2.3缝隙连接

缝隙连接通道直接影响相邻心肌细胞间的微环境并参与细胞间各种信息的传递，调控心肌电传导。CX由超过20个不同基因编码组成，这些基因结构相似，但N端保守，参与CX六聚体的组装；C端胞内尾部的长度和组成具有可变性，故CX基因突变可以导致缝隙连接功能的障碍[17]。

2.3.1分类 在缝隙连接中，不同的CX的分布，数量和功能均不相同。分布在心脏上的缝隙蛋白主要包括CX40、CX43、CX45,它们在不同的心肌细胞上表达各不相同[18]。CX43主要表达于心房和心室，而CX40、CX45的表达具有区域选择性。在心房肌上，主要是CX40和少量的CX45共表达，但在心室肌上，CX43高表达的同时并与微量的CX45共表达[19]。心肌不同部位的缝隙连接的异常也参与不同类型心律失常的形成。当缝隙连接异常发生在窦房结和肺静脉时，引起的电兴奋异常与房性心律失常有关[20]。当缝隙连接异常发生在心肌缺血损伤所致的房室结时，导致PQ间期延长，传导阻滞[21]。

2.3.2CX40、CX45 CX40在心房中选择性表达并具有调节心房的电兴奋作用。当CX40基因的P88S、G30D、A96S位点突变后，表达产物可以通过作用于与CX43共有的缝隙连接负性功能区减慢心肌传导，增加心房颤动(AF)的发生[22]。此外，CX40基因GJA5的多态性改变可以通过改变TATA盒序列来调控CX40mRNA表达，最终诱发AF[23]。心房中CX40、CX43的正常表达具有维持心房电生理稳定性作用，当CX40、CX43表达下降时可以导致AF的发生[24]。研究发现，增加代谢综合征模型鼠的极低密度脂蛋白水平可以在转录和翻译水平上降低CX40、CX43的表达并导致CX40、CX43糖基化，同时伴有房室传导减慢，房室重塑和收缩功能异常最终诱发心律失常[25]。CX45主要在窦房结和房室结中表达，Ye等[26]用闰盘缺乏细胞重建CX40/CX45和CX43/CX45不同结构的闰盘，发现人类和啃齿类动物CX43/CX45功能相似，能够减慢闰盘间传导，降低动作电位频率，进而减慢房室结的传导。

2.3.3CX43及其相关连接 各种原因引起的CX43的异常包括CX43的分布异常、数量变化、磷酸化水平、重塑和功能异常。在心室肌细胞中，CX43主要分布于心肌细胞的纵向接触面，而在细胞侧面则分布较少，这使得心室肌在垂直轴上的传导速率是侧边传导速率的3倍[27]。因此当急性心肌梗死后心肌损伤边缘区(IBZ)的CX43分布异常，垂直轴向CX43数量减少会导致心肌传导减慢、传导不均甚至传导阻滞并诱发折返性心律失常[28]。Gonzalez等[29]发现在杜氏营养不良性心肌肥厚(DMD)患者和动物模型中，CX43异常定位到了侧面心肌细胞上，而抑制心肌细胞侧面CX43的功能会降低心律失常的发生率和死亡率。另外，缝隙蛋白表达于心肌细胞的同时也表达于非心肌细胞(成纤维细胞，内皮细胞，巨噬细胞)。Wilhelm等[30]用完整的慢病毒将CX43稳定转移到心肌缺血损伤瘢痕区的成纤维细胞和CD45+免疫细胞上，发现这些细胞能够转移心肌细胞侧面的CX43，进而闰盘中CX43的表达增加可以降低缺血损伤，增加瘢痕区的传导速率。因此他们认为通过非心肌细胞的活性传导，CX43基因治疗可望成为临床上简单易行的降低心肌梗死后室性心律失常的生物治疗方式。

现研究表明，多种心脏病理状态伴有心肌CX43表达量的下降，而上调CX43具有心脏保护作用。Dhein等[31]收集160例AF和窦性心律患者的左房组织，发现AF病人的CX43表达增加并伴有CX43侧边分布，横向传导增多。当应用美托洛尔后，CX43表达进一步增加，侧边分布减少，横向传导减慢。另外CX43作为许多丝-苏氨酸蛋白激酶的靶向位点，可以通过改变蛋白激酶和磷酸酶的兴奋性来改变CX43的磷酸化水平并参与心肌电紊乱和心律失常的发生[32]。研究发现micRNA-1下调会导致CX43异常分布并诱发室性快速性心律失常，而选择性的血管紧张素受体Ⅰ型(AT1R)抑制剂可以通过改善micRNA-1的表达降低CX43的磷酸化水平。Antonio等[33]构建主动脉缩窄的小鼠左室肥厚模型，检测到micRNA-1水平下降，CX43表达增加，在细胞水平上，用病毒转染使micRNA-1在异丙肾上腺素所致的左室肥厚小鼠中过表达会降低CX43的表达和磷酸化水平。

CX43不仅存在于缝隙连接，也存在于线粒体中。CX43参与线粒体的呼吸、钾电流的调控、活性氧(ROS)形成、渗透孔的开放和自噬等过程[34]。Masahito等[35]用CX43抑制剂CBX不仅可以阻断细胞CX43半通道和线粒体上的CX43，还可以阻断线粒体KATP通道，这表明CX43可能通过调控线粒体K-ATP通道引发心律失常。还有学者认为ROS可以引发局灶性兴奋和折返，用线粒体靶向抗氧化剂可以起到改善CX43重塑和心肌电偶联的作用，对保护氧化应激导致的缝隙连接重塑和心律失常发挥重要作用[36]。

CX43发挥功能还与一些连接蛋白有关。在心肌中，ZO-1是定位于闰盘和细胞侧膜的支架蛋白，可以直接调控CX43的数量，分布和功能[37]。Siragam等[38]将小鼠心房肌细胞(HL-1)心肌细胞CX43基因p.S358L稳定突变后，ZO-1的表达和分布都会下降，传导减慢。当ZO-1减少时，CX43磷酸化水平降低，细胞传导减慢。Indra等[39]发现CX43的C端的最后5个氨基酸残基(378-372)在CX43与ZO-1相互连接中起重要作用，如果删除CX43的C端这5个残基，胎鼠和成年鼠的体表ECG均表现出明显广泛的QRS波异常。

2.4离子通道

钠通道由1个a亚基和2个β亚基组成。对钠电流起主要作用的是β1亚基，它能够使通道迅速回到静息状态并促进NAV1.5二聚体之间的相互作用。当Nav1.5基因SCN5A突变时，动作电位的改变可以引发室性心律失常和长QT综合征并最终导致猝死[40]。

Nav1.5主要存在于闰盘中，并与其他蛋白相互作用。桥粒、缝隙连接和钠通道共同形成一个相互作用的电压门控钠通道复合体(VGSC)[41]。新斑蛋白2表达下降时，将出现钠电流减小；而桥粒芯蛋白表达减少时，心肌传导减慢，心室兴奋时间延长，钠电流振幅减小；桥粒斑蛋白减少时，会出现区域性的传导减慢和Nav1.5的异常分布，CX43异常定位和发生室性心动过速[42]。此外，Rengasayee等[43]在高分辨率显微镜下观察到Kir2.1通道沿着Nav1.5通道定位于周围连接，当神经元闰盘损伤时，周围连接延伸肿胀，宽度增加，从而钠钾电流异常并导致传导减慢和心律失常。Kir2.1具有靶向调控心肌细胞之间的缝隙耦连，各向异性传导和心律失常发生的作用。

2.5锚蛋白-G

锚蛋白-G作为VGSC的组成成分之一，与Nav1.5连接的同时与新斑蛋白2、CX43相互作用。实验在缺血再灌注模型犬术后48 h和5天两个时间段分别观察心外膜边缘区Na通道，锚蛋白G，缝隙连接蛋白表达，发现缺血再灌注48 h后Na通道和锚蛋白G没有明显改变，CX40/CX43开始改变但没有明显的侧面分布，而5天后锚蛋白G表达增加出现重塑并伴有Na通道的下降，并证明在心肌缺血后期锚蛋白-G表达增强可以通过调节Nav1.5通道并把它定位到肌纤维膜上，从而对心肌产生保护作用[44]。

3 研究现状

近年来研究的心律失常药物主要集中作用在膜离子通道，但这些药物本身具有致心律失常作用。目前调节CX43表达已经成为抗心律失常药物研究的新靶点。Kerstin等[45]研究表明，缝隙连接改造剂ZP123不仅可以调控心室颤动中细胞膜上CX43的表达、分布和磷酸化，在犬心室颤动模型上，ZP123能够通过改善CX43的重塑降低复律时的除颤能量。现在学界对闰盘蛋白的结构、分布、功能、调控机制已经有初步的了解，关于闰盘蛋白和心律失常之间的相关机制研究已经取得很大的进展，已经发现micRNA、Wnt通路、AMPK通路、CaMKII通路等机制参与闰盘蛋白的调节，影响心律失常的发生发展[46]。但现在闰盘蛋白药物的研究仍然较少，仍具有广阔的开发价值。因此闰盘蛋白有望成为心律失常的靶向治疗上的新突破。

4 结论

闰盘作为心肌电生理基本结构，具有复杂的结构，其间的闰盘蛋白相互影响，在心律失常的发生发展预后中发挥重要作用。心律失常作为心血管领域的常见疾病，其发病率和死亡率较高，但治疗上仍然存在挑战，需要寻找新的治疗靶点。因此增强缝隙连接的交流和闰盘蛋白间相互作用的调节有望成为保护、调控甚至逆转心律失常的新型治疗手段。