Nod样受体蛋白3炎性小体在脑缺血再灌注损伤中的研究现状

丁承程，李国忠

Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小体是骨髓源性的巨噬细胞中的固有免疫相关蛋白复合物，除了能够参与介导、调控多种免疫反应，介导细胞死亡和组织损伤，还促进了脑缺血再灌注损伤的发生发展。NLRP3炎性小体的激活是一个多因素参与的过程，目前对于其机制的研究尚不明确，本文对NLRP3炎性小体与脑缺血再灌注关系的研究现状和进展进行介绍。

1 Nod样受体蛋白3炎性小体

炎性小体是胞内蛋白复合物，典型组成包括Nod样受体（nod-like receptor，NLR）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱天冬酶-1（pro-caspase-1）前体[1]。

NLR是一类胞内模式识别受体（pattern- recognition receptors，PRRs），由N端结构域、C端结构域和中央的核苷酸结合寡聚化结构域组成。其中N端结构域已知有4种：嘌呤结构域（pyrin domain，PYD）、caspase募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）、杆状病毒IAP重复序列（baculoviral IAP repeat，BIR）结构域和酸性反式激活结构域。ASC由PYD和CARD两部分组成，这两部分作为双重接头蛋白分子，以桥梁的形式将NLRP3及半胱天冬酶原-1连接起来形成炎性小体。每个NLRP3炎性小体有两个半胱天冬酶原-1，ASC通过调节两个单体的空间构象，使之成为有活性的半胱天冬酶-1（p20）和无活性的半胱天冬酶原（p10）两个亚基。p20能够剪切白介素前体（pro-IL）-1β和pro-IL-18，引起细胞凋亡[1]。

2 Nod样受体蛋白3炎性小体的活化机制

NLRP3可识别多种激活物，外源性的激活物常见多种细菌，内源性的有尿酸盐结晶、ATP、脂质体、活性氧（reactive oxygen spieces，ROS）、补体、淀粉样小体和错误折叠的蛋白等[2]。

NLRP3炎性小体在体内处于自身抑制状态，但是易于被激活。脑缺血再灌注时会发生自由基损伤、钙超载、微循环障碍及白细胞（主要是中性粒）损伤作用，这些损伤都能够被NLRP3识别。NLRP3炎性小体的激活机制还未完全明确，目前认为有以下几种。

2.1 活性氧及线粒体功能紊乱介导活化机制 ROS可引起氧化应激导致细胞凋亡，在脑缺血再灌注时大量产生ROS。其来源一般有两种：线粒体和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）。线粒体的活性氧（mitochondrial ROS，mROS）作为线粒体的产物能激活NLRP3炎性小体，也是形成成熟IL-1β所需的第二信号[3]。有研究表明，用mROS清除剂二苯基氯化碘（diphenyliodonium chloride，DPI）处理小鼠的巨噬细胞后，脂多糖诱导的NLRP3及IL-1β、IL-18表达量降低，但这一现象只在NLRP3炎性小体启动的这一过程能够观察到[4]。细胞质中NADPH氧化酶产生的ROS最初被认为是NLRP3炎性小体活化所需信号，并且有化学抑制剂的实验支持这一理论[5]。有研究显示，人外周血单核细胞和鼠的巨噬细胞缺乏有活性的NADPH氧化酶，但是仍能观察到有NLRP3炎性小体的活化[6]。

用化学抑制剂扰乱线粒体功能，可观察到NLRP3炎性小体的激活[7]。然而，化学抑制剂会产生副产物，尤其在高浓度的时候，所以该机制尚有争议。另外，氧化的线粒体的DNA释放到细胞质中，能与NLRP3相互作用，并引起NLRP3下游的活化[8]。

2.2 低氧介导激活 脑缺血再灌注损伤伴随着低氧，造成线粒体结构和功能受损，神经递质失调及酸碱平衡紊乱。有研究证实，小鼠在脑低氧环境下能够增加NLRP3的基因及其蛋白的表达，并通过限制pro-IL-1β的自噬使其水平升高。脑缺氧早期，海马和丘脑的星形胶质细胞中就能观察到NLRP3，之后发现星形胶质细胞和小胶质细胞均有表达[9]。另有研究表明，人前列腺上皮细胞在低氧环境下有NLRP3、黑色素瘤缺乏因子-2（absent in melanoma 2，AIM-2）和pro-IL-1β的表达升高。

2.3 钾外流介导激活 在经典通路及非经典通路中钾离子外流都是NLRP3炎性小体活化的必需条件[10]。大部分NLRP3的激活物，如ATP、尼日利亚菌素和颗粒物质都能够造成钾离子外流，从而引起NLRP3炎性小体活化。在非细胞系统中，低浓度的钾离子也能够引发NLRP3炎性小体聚集[11]。钾离子的外流加速了NLRP3炎性小体的活化。在钾离子无法外流的情况下，NLRP3炎性小体在巨噬细胞中发生活化突变体，且不被细胞外高钾离子浓度所影响[12]。这提示了细胞内钾离子浓度的降低可能诱发NLRP3炎性小体构象的改变。

2.4 溶酶体破裂 微粒物质通过细胞内吞作用、损伤溶酶体膜，导致组织蛋白酶B释放到细胞质中，从而激活NLRP3炎性小体[13]。释放到细胞质中的组织蛋白酶B、颗粒物质也引起K离子外流，进一步激活NLRP3炎性小体[14]。用组织蛋白酶B抑制剂CA-074-Me处理巨噬细胞能导致NLRP3活化被抑制。但组织蛋白酶B缺陷的巨噬细胞中NLRP3无法被微粒物质激活，而IL-1β并没有减少，因此推测溶酶体破裂释放组织蛋白酶B在激活NLRP3炎性小体中仅起到部分作用[15]。

2.5 其他机制 NLRP3炎性小体的活化多需要钙离子的参与，一方面是因为钙离子动员可引起钾离子外流，另一方面是因为脑缺血再灌注时，钙超载促进线粒体损伤，释放更多ROS，进一步活化NLRP3炎性小体。但是钙离子对AIM2和NLR家族CARD域蛋白4（NODlike receptor family CARD-containing 4 protein，NLRC4）炎性小体的活化没有作用[16]。钙离子螯合剂可抑制IL-1β的分泌[17]。内质网作为细胞内钙池在此过程中起重要作用，使用药物抑制剂或是shRNA敲除内质网上的钙离子释放通道，可减弱钙离子动员及NLRP3炎性小体活化[18]。

3 脑缺血情况下可影响NLRP3炎性小体的药物

3.1 夹竹桃麻素 NADPH和夹竹桃麻素都能显著减少脑缺血再灌注损伤引起的NADPH氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）2、NOX4和ROS的增加，显著抑制核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor-κBα，IκBα）磷酸化和降解，NF-κBp65的核定位，还有NF-κB靶基因环氧化酶（cyclooxygenase，COX）2的表达和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表达。在大鼠脑梗死模型中，NADPH和夹竹桃麻素都能抑制缺血的大脑皮层NLRP3、ASC、半胱天冬酶-1、IL-1β和IL-18的表达，并能减少脑梗死体积，提高梗死后的存活率及神经功能的恢复[19]。

3.2 鸢尾素 鸢尾素是骨骼肌来源的激素，可在不同物种的各种组织中合成，有抗脑缺血性损伤及脑保护作用。研究表明，神经元氧糖剥夺后，鸢尾素及其前体蛋白Ⅲ型纤维蛋白结构域5表达明显减少，而氧化应激和ROS-NLRP3信号被激活；用鸢尾素或NLRP3抑制剂能够抑制氧糖剥夺引起的氧化应激和炎症，且鸢尾素的调节作用可被NLRP3过表达抑制。因此，鸢尾素可能通过抑制ROS-NLRP3信号通路减轻氧糖剥夺引起的神经元损伤[20]。

3.3 核因子E2相关因子2相关药物 有研究表明核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）在脑缺血再灌注损伤中能通过硫氧还蛋白（thioredoxin-1，Trx1）/硫氧还蛋白结合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）抑制NLRP3炎性小体的形成的，从而起到脑保护作用。TXNIP从Trx1/TXNIP复合体分离下来，与NLRP3活化密切相关。在肝损伤和严重的狼疮性肾炎患者中证实，Nrf2能促进抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）基因激活，抑制NLRP3炎性小体活化。小鼠大脑中动脉闭塞模型中，叔丁基对苯二酚治疗上调Nrf2之后，TXNIP、NLRP3及caspase-1、IL-18、IL-1β的表达均明显减少，而敲除Nrf2和Trx1则相反，在敲除Trx1时还抑制了Nrf2的保护作用。该研究认为，在脑缺血再灌注损伤时Nrf2通过对Trx1/TXNIP复合体的调节抑制NLRP3炎性小体的活化[21]。

在氧糖剥离再灌注模型建立之前用叔丁基对苯二酚或Nrf2 CRISPR质粒对BV2细胞做预处理，Nrf2活化可抑制NLRP3炎性小体的表达及下游IL-1β的形成。并且，NLRP3炎性小体的活化对ROS水平很敏感，Nrf2能够降低ROS的产生。另外，作为一个Nrf2靶向ARE的基因，NADPH醌氧化还原酶参与了NLRP3炎性小体的抑制[22]。这给脑缺血再灌注损伤提供了一个新的治疗靶点。

3.4 白藜芦醇 白藜芦醇是一种特异的去乙酰化酶沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1（silent mating-type information regulator2 homolog 1，Sirt1）激动剂，有研究表明它通过抑制NLRP3炎性小体活化后Sirt1依赖的自噬活动来改善脑缺血再灌注损伤。在大鼠大脑中动脉闭塞模型中，病变侧大脑半球NLRP3、半胱天冬酶-1、IL-1β和IL-18表达上升，并上调自噬活动。白藜芦醇可减轻缺血再灌注损伤中NLRP3炎性小体引起的炎症反应，下调自噬，减小脑梗死体积、减轻脑水肿，提高大鼠的神经功能评分。该抑制作用能够被脑室内的注射白藜芦醇抑制剂3-MA阻断。转染Sirt1小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）能阻断白藜芦醇对自噬活动的抑制，并抑制NLRP3炎性小体的活化[23]。

3.5 萝卜硫素 萝卜硫素（sulforaphane，SFN）对脑缺血再灌注损伤有保护作用，但其机制尚不清楚。用SFN处理大脑中动脉闭塞大鼠，可抑制炎性小体活化及半胱天冬酶-1，IL-1β和IL-18的表达，减少脑梗死体积，提高神经功能评分，减少中性粒细胞浸润[24]。

3.6 其他 有研究提示，间歇性禁食、静脉注射免疫球蛋白、米诺环素、大黄酚、酪氨酸激酶等均能在脑缺血再灌注中抑制NLRP3炎性小体的活化[25-29]。伞形花内酯可通过上调过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）γ的表达抑制TXNIP/NLRP3炎性小体[30]。

综上所述，NLRP3在脑缺血再灌注损伤中是通过形成炎性小体，介导IL-1β等的产生，在固有免疫中起重要作用。很多针对NLRP3炎性小体的药物也在动物实验中取得良好的效果。但是由于鼠NLR家族成员与人NLR家族成员不完全相同，NLRP3炎性小体在人体中确切活化机制仍不明确，人体中NLRP3对炎症损伤的介导机制及治疗靶点仍需进一步研究。

【点睛】Nod样受体蛋白3炎性小体能够识别脑缺血再灌注的损伤信号并诱发炎症趋化，最终引起脑组织损伤。