DNJ双层渗透泵片的制备及比格犬体内药动学研究

2019-01-02孙照英聂彦彦赵华南刘志明

生物质化学工程 2018年6期

孙照英，聂彦彦，赵华南，刘志明*

(1. 东北林业大学材料科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150040； 2. 青岛海慈医疗集团，山东青岛 266100； 3. 哈药集团技术中心，黑龙江哈尔滨 150020)

1-脱氧野尻霉素(DNJ)为桑叶的提取物，是一种强力降血糖物质，可用于治疗糖尿病[1]。1-脱氧野尻霉素进入体内后存在释放不平稳的特点，导致血糖过度降低而出现不良反应，因此患者依从性差[2-3]。而普通制剂存在给药频繁、血药浓度波动大、不方便患者长期服用等缺点，只有研发出能持续平稳的降血糖药物才能适应目前的临床需要。渗透泵控释制剂是以零级恒速释药为基本特征，以膜内外的渗透压差为释药动力的一种新型制剂。渗透泵片释药行为不受环境pH值、胃肠蠕动等因素影响，可最大限度地避免或减少血药浓度波动，提高药物制剂的安全性和有效性，可减少服药次数，提高患者的依从性，可避免普通制剂存在的不足，并且开发周期短，经济效益好[4-9]。本研究将DNJ制备成双层渗透泵片制剂，优化处方后进行了比格犬体内药动学研究，以期为临床用药提供理论依据。

1 实验

1.1原料、试剂与仪器

1-脱氧野尻霉素(DNJ)原料药、DNJ速释片(40 mg)，哈药集团制药总厂；DNJ对照品(纯度99.2%)，中检所；聚氧乙烯(PEO)，上海昌为医药辅料技术有限公司；羟丙基甲基纤维素(HPMC)E50、聚乙二醇(PEG)4000、氯化钠和滑石粉，均购于安徽山河辅料有限公司。醋酸纤维素(CA)、乙醇、甲醇、乙腈、醋酸铵、乙醚、二氯甲烷，均为市售分析纯试剂。

TDP型单冲压片机，上海第一制药机械厂；WBF5包衣锅，重庆英格造粒包衣技术有限公司；1260高效液相色谱仪和VK7030全自动溶出仪，美国Agilent公司。

健康比格犬6只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重(12±2)kg。

1.2DNJ双层渗透泵片的制备

1.2.1基本处方在前期实验的基础上确定了基本处方，具体见表1。

表1 DNJ 双层渗透片基本处方

1.2.2片芯的制备 DNJ双层渗透泵片由片芯和包裹片芯的带有释药孔的半透衣膜组成，其中片芯分别为含药层和助推层。含药层制备方法如下：按处方将药物DNJ与辅料PEO(Mr6×106)、HPMC E50混合均匀，加水制成软材，制备粒径为0.7～0.8 mm的颗粒，烘干得A颗粒[10-11]。

助推层制备方法如下：按处方将辅料PEO(Mr6×106)、氯化钠、HPMC E50混合均匀，加水制成软材，制备粒径为0.7～0.8 mm的颗粒，烘干得B颗粒。

将A颗粒和B颗粒分别加入滑石粉，采用单压冲片机，10 mm浅凹冲，将含药层和助推层压制成双层片芯[7]，片芯硬度为9 kg/cm2。

1.2.3包衣的制备将CA 300 g溶于2 000 mL 50%乙醇中，然后再加入100 g的PEG 4000混合，搅拌2 h。在包衣锅转速为25 r/min，包衣液流量为7 mL/min，包衣床温度45 ℃的条件下对DNJ双层渗透泵片片芯进行包衣[12]。控制包衣的质量增率在3%，包衣后在45 ℃下干燥0.5 h。干燥后，将包衣片用激光打孔机打释药孔(孔径0.6～0.7 mm)，即为DNJ双层渗透泵片，含药量40 mg/片。

1.3体外释放度的测定

按《中国药典》2015年版四部通则释放度测定法第二法(桨法)测定[12]。溶出介质水900 mL，转速为50 r/min，在0.5、 1、 2、 4、 6、 8和12 h取适量溶液，以0.22 μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。取DNJ对照品，精密称定，加水溶解并稀释制成0.05 g/L DNJ作对照品溶液。精密量取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，注入HPLC色谱仪[9]，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片的释放度。释放度(r)公式如下：

r=Ai×Mr/Xr×40

式中:Ai—供试品峰面积;Mr—对照品称样量;Xr—对照品含量; 40为每片含40 mg 1-脱氧野尻霉素。

精密称取1-脱氧野尻霉素对照品适量，分别加水制成质量浓度为10、 20、 30、 40、 50和60 mg/L的系列标准溶液。以1-脱氧野尻霉素峰面积(A)对标准血药质量浓度(C,mg/L)进行线性回归，得标准曲线：C=1 214.5A-23.273，R2=0.998 9。在质量浓度10～60 mg/L范围内线性关系良好。

1.4释放度的影响因素考察

1.4.1含药层HPMC E50用量 HPMC E50作为含药层黏合剂，分别制备每片中羟丙基甲基纤维素E50用量为5、 10和15 mg的优化处方后的DNJ双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.2助推层PEO用量 PEO(Mr6×106)作为助推材料，分别制备每片中PEO(Mr6×106)用量为70、 80和90 mg的1-脱氧野尻霉素双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.3包衣层CA用量 CA作为控释成膜材料，分别制备每片中CA用量为10、 15和20 mg的优化处方后的1-脱氧野尻霉素双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.4包衣层PEG 4000用量 PEG 4000作为包衣层致孔剂，分别制备每片中PEG 4000用量为4、 5和6 mg的优化处方后的DNJ双层渗透泵片，分别取6片测溶出曲线。

1.4.5体外不同pH值溶出介质分别取6片优化处方后的DNJ双层渗透泵片以pH值1.2盐酸盐溶液、 pH值4.5醋酸盐溶液和水为溶出介质，测定溶出曲线。

1.5比格犬体内药动学实验

1.5.1血样的采集取健康比格犬6只(雌雄各半)，随机分为两组，采用两制剂两周交叉进行设计试验。实验前禁食12 h，然后分别给药DNJ速释片及双层渗透泵片(主药用量为40 mg)，2次给药间隔为1周。实验前，在Beagle犬静脉处安置一支滞留针，给药前取空白血样，给药后0.5、 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 18和24 h 取血3 mL，置于涂有肝素的离心管中，以3000 r/min离心15 min，取上层血浆，置于-20 ℃的冰箱里保存待测[13]。

1.5.2血浆样品的处理和测定精密吸取血浆1 mL置于10 mL具塞离心试管中，加0.1 mg罗红霉素作为内标物，1 mol/L氢氧化钠100 μL，涡旋混匀30 s，加入3 mL乙醚-二氯甲烷(体积比3∶2)，涡旋振摇5 min，3000 r/min离心15 min后，定量吸取有机层2.5 mL放入另一洁净玻璃试管中，置于40 ℃恒温水浴中用氮气吹干，氮气吹干后的残渣加甲醇100 μL涡旋30 s，复溶后精密吸取20 μL注入HPLC中进行分析。

1.6分析测试方法

1.6.1高效液相色谱分析条件采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，柱温为35 ℃，以0.05 mol/L醋酸铵溶液(pH值5.25±0.05)-乙腈(体积比47.5∶52.5)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为320 nm。

1.6.2标准曲线的绘制精密称取DNJ对照品适量，分别加水制成质量浓度为0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 mg/L的系列标准溶液。精密吸取空白血浆1 mL，置于10 mL具塞离心试管中，分别加入DNJ系列标准溶液，使血浆中的药物浓度分别为0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25和0.30 mg/L。按1.5.2节操作，以DNJ峰面积(A)对标准血药质量浓度(C)进行线性回归，得标准曲线：C=1452.9A-14.753，R2=0.9981，在质量浓度0.05～0.3 mg/L范围内线性关系良好。

2 结果与分析

2.1不同条件对体外释药性能的影响

2.1.1含药层HPMC E50用量 HPMC E50作为含药层黏合剂，分别制备每片中羟丙基甲基纤维素E50用量为5、 10和15 mg的双层渗透泵片，取6片测定溶出曲线。考察HPMC E50用量对药物释放度的影响，结果见图1。由图可知，随着双层渗透泵片中HPMC E50用量从5 mg 增加到15 mg，溶出释放变慢，这是由于HPMC为含药层的黏合剂，用于增大药物黏度，所以羟丙基甲基纤维素含量越高，药物溶出越慢。而溶出速率太快，会使双层渗透泵片的缓释能力减弱，溶出太慢则会使溶出时间过长，因此溶出速率居中比较适宜(下同)。综上，当HPMC用量为10 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.2助推层PEO用量 PEO作为助推材料，分别制备每片含PEO(Mr6×106)70、 80和90 mg的双层渗透泵片，取6片测溶出曲线。考察PEO用量对药物释放度的影响，结果见图2。

图1 不同HPMC E50用量药物溶出曲线Fig. 1 Drug dissolution curve with different dose of HPMC E50

图2 不同PEO(Mr 6×106)用量药物溶出曲线Fig. 2 Drug dissolution curve with different dose of PEO(Mr 6×106)

由图2可以看出，随着双层渗透泵中PEO用量从70 mg增加到90 mg，吸水膨胀速度加快，推动药物的力量变大，释放药物的速度加快，即PEO用量越高溶出越快。当PEO用量为80 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.3包衣层CA用量 CA作为控释成膜材料，分别制备每片含CA 10、 15和20 mg的双层渗透泵片，取6片测释放曲线。考察CA用量对药物释放度的影响，结果见图3。

由图3可知，随着双层渗透泵片中的CA(控释成膜材料)的用量从10 mg增加至20 mg，薄膜包衣层增厚，吸收水分速度变慢，助推层吸水膨胀速度变慢，推动药物力量变小，药物溶出变慢，即CA用量越高溶出越慢。当每片含CA用量为15 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.4包衣层PEG 4000用量 PEG 4000作为包衣层的致孔剂，分别制备每片中PEG 4000用量为4、 5和6 mg的双层渗透泵片，取6片测溶出曲线。考察PEG 4000用量对药物释放度的影响，结果见图4。

图3 不同CA用量药物溶出曲线Fig. 3 Drug dissolution curve with different dose of cellulose acetate

图4 不同PEG 4000用量药物溶出曲线Fig. 4 Drug dissolution curve with different dose of PEG 4000

由图4可知，随着双层渗透泵片中PEG 4000(包衣层的致孔剂)的用量从4 mg增至6 mg，控释膜上空隙增多，药物溶出加快，即PEG含量越高溶出越快。当PEG 4000用量为5 mg时，药物溶出速度最为适宜。

2.1.5pH值分别取6片双层渗透泵片，以pH值1.2盐酸溶液(8.33 mL盐酸溶解于水至1000 mL)、pH值4.0醋酸盐溶液(醋酸和醋酸钠质量比为4.4∶1溶解于水至1000 mL)和水作为溶出介质，计算每片的释放度[14]，结果见图5。

从图5中可看出，DNJ双层透泵片在pH值1.2、pH值4.0、水介质(pH值7.0)中溶出速度基本一致，说明控释层包衣功能良好，不受体内pH值变化的影响。体内pH值从胃部的酸性到水的中性的变化，不影响DNJ双层渗透泵片药物释放的控释效果。药物12 h溶出完全，且全程近似恒速缓慢释放。

2.2双层渗透泵片在比格犬体内药动学

采用统计矩的非隔室动力学理论对6只比格犬的血药浓度进行处理[15-16]，其中药物释放的峰质量浓度(Cmax，μg/L)和达峰时间(tmax，h)均采用实测值。平均血药浓度-时间曲线如图6所示。速释片与双层渗透泵片主要药动学参数见表2。结果表明：速释片的Cmax为(987.0±114.3) μg/L，双层渗透泵片的Cmax为(478.1±88.7) μg/L，速释片的最高血药浓度约为双层渗透泵片的2倍；双层渗透泵片的tmax为(9.3±3.8) h与速释片的tmax为(4.4±2.2) h相比tmax显著延迟，达到了缓释的目的。AUC0～24 h为血药浓度-时间曲线下面积，由表2可以看出，速释片与双层渗透泵片数值接近，说明相对生物利用度相同，药效一致。

图5 1-脱氧野尻霉素在不同pH值介质中溶出曲线Fig. 5 Dissolution curve of 1-deoxynojirimycin in medium with different pH value

图6 比格犬口服DNJ速释片和双层渗透泵片后的经时血药浓度曲线(n=6)Fig. 6 Blood concentration and time curve of Beagle dogs after oral DNJ immediate release tablets and bi-layer osmotic pump tablets(n=6)

生物利用度是衡量药物吸收速度和程度的综合参数，是评价药物制剂质量的重要指标。以统计结果中的血药浓度-时间曲线下面积计算速释片与双层渗透泵片的相对生物利用度[17-18]，相对生物利用度的计算公式如下：

Fr=AUCT×DR/AUCR×DT×100%

式中：Fr—相对生物利用度，%； AUC—血药浓度-时间曲线下面积，μg·h/L；D—给药剂量，mg; T为双层渗透泵片(40 mg/片)， R为速释片(40 mg/片)。

与速释片相比，DNJ双层渗透泵片的相对生物利用度为(96.1±9.8)%，双层渗透泵片与速释片吸收程度生物等效，其90%置信区间为84.8%～103.7%。

表2 比格犬口服DNJ速释片和双层渗透泵片后药动学参数(n=6)

DNJ双层渗透泵片在体外pH值1.2、pH值4.0和水介质中溶出速度基本一致，说明控释层包衣功能良好，不受pH值变化的影响，呈线性恒速释放。在体内DNJ双层渗透泵片的tmax为(9.3±3.8) h与速释片的tmax为(4.4±2.2) h相比显著延迟，达到了缓控释的目的。速释片与双层渗透泵片的血药浓度-时间曲线下面积AUC0～24 h的数值接近，说明相对生物利用度相同。说明体内外药物相关性良好。