束缚应激致福利损伤小鼠肝脏中钙调蛋白的表达*

马 畅 赵迎峰 梁 磊 尤金炜 董 敏 恽时锋

（1.南京军区南京总医院比较医学科，全军实验动物科普与伦理教育基地，全国科普教育基地，南京 210002）（2.南京军区南京总医院干部保健科，南京 210002）

实验动物是生命科学研究和发展的重要支撑条件，其福利水平对科学研究有着重要的影响。福利受损使实验动物不能实现康乐状态（well-being）[1]，其生存质量下降、机体各系统紊乱，这将会降低研究结果的可靠性[2-3]。束缚应激导致的生理变化是一个复杂的生理调控过程，最终导致体外表征的出现，这一过程必然是由多种调控蛋白参与其中。钙调素（calmodulin，CaM）是一种多功能调节蛋白，广泛表达于多种真核细胞中，作为 Ca2+的受体蛋白，其对多种细胞内Ca2+依赖的细胞功能和酶系统都有重要的调节作用[4]。本研究采用动物实验中常用的ICR小鼠，通过束缚应激以降低其福利水平，观测其肝组织中CaM表达水平的变化，探寻实验动物福利与CaM之间的联系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲育环境

SPF级雄性 ICR小鼠20只，3周龄，18～19 g，由南京总医院比较医学科提供 SCXK（军）2012-0014，实验动物使用许可证号为 SYXK（军）2012-0047。全价颗粒饲料由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供。

1.2 实验分组和慢性束缚应激模型建立

20只ICR小鼠随机挑选并分组：对照组（n=10）：常规饲养；束缚组（n=10）：参照文献[5]，使小鼠保定于束缚器内（限制其自由活动，但无压迫感），实验期每日8：00、15：00 开始，每次束缚 1 h，期间禁食禁水，干预期一周。

1.3 试剂及仪器

RIPA蛋白裂解液（碧云天），一抗 CaM antibody、CaMKⅡantibody、GAPDH antibody（Santa Cruze），二抗山羊抗兔-HRP、山羊抗小鼠-HRP（Santa Cruze），Protein Marker、BCA Protein Assay Kit（Takara），Acr、Bis、Tris（Sigma），ELISA试剂盒（Ray Biotech）。 垂直电泳系统、酶标仪（Bio-red），5200 全自动化学发光图像分析系统（Tannon），7600全自动生化分析仪（日立）。

1.4 样本采集与指标测定

1.4.1 记录小鼠的初始、终末体质量和实验期间进食量，计算体增重和饲料能效比。

1.4.2 实验期结束，小鼠经眼眶静脉丛收集血液样品，室温下静置 1 h，5 000 r/m in离心 15 m in，分离血清，-40℃冰箱保存。ELISA试剂盒检测皮质酮和促肾上腺皮质激素水平，全自动生化分析仪检测主要肝功能指标谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶。

1.4.3 Western blot检测CaM、CaMKⅡ蛋白表达水平：取各组小鼠肝脏组织约100 mg，加预冷的RIPA蛋白裂解液1 m L，冰浴匀浆，13 000 r/min低温离心，BCA Protein Assay Kit测定上清液的总蛋白浓度。各组蛋白上样量为40μg，经10%SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转印至NC膜，PBST配制10%脱脂牛奶用于封闭，适当比例稀释的 CaM、CaMKⅡ和GAPDH一抗4℃孵育过夜，PBST洗膜，相应二抗37℃孵育30 min，洗膜后用化学发光试剂盒显影，应用Tannon化学发光图像分析仪拍照分析，每组样本进行3次重复。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 体增重与饲料能效比

见表1。经过为期一周的束缚应激后，束缚组小鼠体增重较对照组显著减少（P＜0.01），饲料能效比显著降低（P＜0.01）。

表1 体增重与饲料能效比（±s±s，n=10）Tab le 1 Body weight gain and food efficiency ratio（±s±s，n=10）

表1 体增重与饲料能效比（±s±s，n=10）Tab le 1 Body weight gain and food efficiency ratio（±s±s，n=10）

注：与对照组比较，**P＜0.01Note： Compare with untreated group， **P＜0.01.

对照组10.10±1.45 20.37±1.88束缚组 6.06±1.87** 14.86±3.73**

2.2 免疫功能和神经内分泌指标

见表2。束缚应激后小鼠的脾脏和胸腺的脏器指数较对照组均显著降低（P＜0.01，P＜0.05），而血清中的皮质酮和促肾上腺皮质激素水平均显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。

表2 免疫学指标与血清 CORT、ACTH的测定结果（±s±s，n=10）Tab le 2 Results ofm easurem en ts of imm unological index， serum levels of CORT and ACTH（±s ±s，n=10）

表2 免疫学指标与血清 CORT、ACTH的测定结果（±s±s，n=10）Tab le 2 Results ofm easurem en ts of imm unological index， serum levels of CORT and ACTH（±s ±s，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compare with untreated group，*P＜0.05，**P＜0.01

0.6628±0.1006 0.2703±0.0415 68.95±8.14 7.61±1.07束缚组 0.5097±0.1198** 0.2514±0.0212* 106.96±9.38** 8.34±1.15对照组*

2.3 主要肝功能指标

见表3。束缚应激后小鼠的主要肝功能指标谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶水平较对照组显著升高（P＜0.05）。

表3 主要肝功能测定结果（±s±s，n=10）Tab le 3 Results ofm easu rem en ts of liver function tests（±s±s，n=10）

表3 主要肝功能测定结果（±s±s，n=10）Tab le 3 Results ofm easu rem en ts of liver function tests（±s±s，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05Note： Compare with untreated group， *P＜0.05

组别 谷草转氨酶AST/（U/L）谷丙转氨酶ALT/（U/L）碱性磷酸酶ALP/（IU/L）127.23±29.89 72.52±16.39 112.31±22.78束缚组 161.66±32.87*106.44±24.11* 145.39±25.91对照组*

2.4 CaM、CaM KⅡ蛋白表达

与对照相比，束缚组小鼠肝脏中CaM和CaMKⅡ相对表达水平均显著上升（P＜0.05），如图1。

3 讨论

图1 各组小鼠肝脏CaM、CaM KⅡ蛋白表达Fig.1 Relative exp ression of CaM、CaM KⅡin liver of different groups

科研工作中各种操作给实验动物带来的心理和生理痛苦是常见的福利伤害[6]，正确评估并加以改善福利伤害是动物福利的主要研究方向。束缚应激是目前常用的一种引发身心压力造成福利损害的实验方法[7]。本实验选取较为公认的动物福利评价指标[8]，综合评价束缚应激对小鼠福利的伤害情况。本实验中生长指标显示，束缚应激后小鼠的体增重和FER均显著下降，提示束缚应激使小鼠生长速度减缓。有研究报道，实验操作能使小鼠免疫器官退化，导致免疫抑制[9]，本实验也得到相同结论，主要免疫器官脏器指数结果显示，束缚组的胸腺指数和脾脏指数明显降低，说明束缚应激可影响小鼠的免疫器官。据以往报道，机体受应激刺激后以下丘脑-垂体-肾上腺通路（HPA）激活为主要特征，而HPA终末产物皮质酮和促肾上腺皮质激素水平上调是其激活的主要表现[10]。本研究的结果表明，束缚组外周血清的皮质酮和促肾上腺皮质激素水平明显升高，表明应激小鼠 HPA轴的激活，改变了其体内相关神经内分泌系统活性。综上指标，我们可以认为束缚组小鼠已经福利受损。

肝脏作为一种重要的代谢器官，应激会影响肝脏疾病的发生、发展和结果。有研究报道情绪应激能显著增大肝脏的血流量[11]。另有研究表明，酒精性肝炎患者的心理应激水平和肝纤维化程度密切相关[12]。Kunkel等研究发现，慢性乙型病毒性肝炎患者血清ALT水平与心理抑郁程度之间有显著的正相关系[13]。在动物模型研究中，应激和肝病之间的密切关系也已得到证实。Iwai等[14]报道电击应激可以加重用四氯化碳处理过的小鼠肝脏损害。而在正常的啮齿类动物中，束缚或电击应激可导致轻度肝损伤，其特点是血清中 ALT水平轻度升高[15-16]。本研究结果显示，束缚应激组小鼠的 AST、ALT和ALP三项肝功能指标均显著升高，表明束缚应激致福利损伤小鼠的肝功能已经受到损害，而且持续慢性应激可以维持这种损伤程度，正如Zhu等[17]的研究结果，慢性束缚应激损害了肝脏的功能。

束缚应激导致的生理变化是一个复杂的生理调控过程，最终导致体外表征的出现，例如当福利水平下降时，动物往往表现出毛色不顺、摄食减少、免疫抑制、代谢及内分泌紊乱等一系列问题，这一过程必然是由多种调控蛋白/因子参与其中。本实验室前期研究结果表明，制动使SD大鼠福利受损时，其肝脏中核因子-κB的蛋白和基因水平均显著升高，预示着核因子-κB的变化参与了福利损伤及机体功能紊乱的调控[18]。在真核生物中，CaM作为胞质溶胶蛋白可调节多种Ca2+依赖的功能和酶活性。Ca2+-CaM信号在许多病理生理过程中起着重要的作用。钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）为广泛分布的多功能蛋白激酶，参与多种生理和病理信号转导，也是影响胞内代谢调节的最重要因素之一[19-20]。为了进一步探究机体内参与应激致福利损伤的信号分子通路，本研究对肝脏组织CaM和CaMKⅡ的蛋白表达水平进行了检测，结果显示束缚应激条件下的这两种蛋白水平均显著升高，因此我们推测束缚应激至机体产生终末代谢物的这一个过程，CaM及其相关调节蛋白参与其中，但 CaM和CaMKⅡ在这一过程中的具体调节机制还不明确，需要我们进一步探索。