过氧化物酶体增殖物激活受体α在对乙酰氨基酚肝损伤的研究进展

张真真,曲爱娟,王艳

(1.北京大学第一医院感染疾病科，北京 100034；2.首都医科大学基础医学院 生理学与病理生理学系，重塑相关心血管疾病教育部重点实验室，北京 100069)

对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是一种常见的解热镇痛药物，正常剂量情况下发挥解热镇痛作用，然而APAP过量时常常引起急性肝损伤甚至诱导肝衰竭，死亡率较高。1966年，Davidson等首次报道了2例由于APAP引起肝坏死的病例[1]。1973年Mitchell等通过APAP动物模型系列研究APAP肝损伤机制，表明APAP经过I相代谢酶细胞色素P450 酶代谢形成活性产物N-乙酰基-对-苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine,NAPQI)，谷胱甘肽(glutathion,GSH)耗竭，NAPQI蓄积与大分子蛋白质结合形成共价化合物，从而造成肝细胞损伤，也称为代谢阶段损伤[2]。2005年Reid等研究表明APAP诱导的肝损伤不仅引起代谢阶段损伤，进一步引起肝细胞内线粒体损伤，氧化应激形成[3]，随后大量研究表明APAP经过代谢阶段以及氧化应激阶段两次打击学说以后触发多条信号通路，最终引起肝细胞损伤[4-5]。其中过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα)是核受体超家族成员之一，参与肝脏代谢酶的调节，本文将综述PPARα在APAP肝损伤的作用机制以及研究进展。

1 APAP肝损伤的发病机制

过量的APAP引起肝损伤在体内经历两次打击学说(代谢损伤以及氧化应激引起的损伤放大)。造成肝细胞坏死，释放损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)，最终引起肝内无菌性炎症反应，对肝损伤和修复发挥双重调节作用。

1.1APAP的代谢治疗剂量APAP大多数通过肝内Ⅱ相代谢酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltrans-ferase,UGT)和磺基转移酶(sulfotransferase,SULT)转化为无毒的葡萄糖醛酸盐或硫酸盐从肾脏排泄，其中UGT酶包括UGT1A1，UGT1A6，SULT酶包括SULT1A1，SULT1A3/3，SULT1E1，少部分通过I相代谢酶细胞色素P450酶系(主要为CYP2E1)转化为活性代谢产物NAPQI,NAPQI随后在谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的作用下与肝内GSH结合，转化为无毒的APAP-GSH，从胆汁排泄；当APAP过量时，将引起NAPQI在体内蓄积，GSH耗竭，过多的NAPQI与肝细胞线粒体内大分子蛋白质共价结合，形成蛋白质共价化合物，抑制线粒体氧化呼吸，引起线粒体氧化应激，活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生，造成线粒体第一次打击[6]。

1.2线粒体氧化应激引起损伤放大APAP代谢损伤仅占很小一部分，当活性代谢产物NAPQI与线粒体大分子蛋白质结合，引起线粒体氧化应激，ROS产生，激活腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]信号通路，早期(0～2 h)引起糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)以及MAP3k混合谱系酶3(mixed lineage kinase 3,MLK3)的激活，而在晚期(2～4 h)则促进凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)激活，两者均能引起丝裂原活化蛋白激酶激酶4/7 (mitogen-activated protein kinase Kinases 4/7,MKK4/7) 激活，最终引起c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 磷酸化，磷酸化的JNK与线粒体外膜蛋白Sab结合，进一步抑制线粒体氧化呼吸，引起第二次打击，ROS持续产生，最终引起线粒体膜通透性孔开放(mitochondria permeability transition,MPT)，膜势能下降，继而肝细胞坏死[4]。

1.3肝细胞坏死APAP引起的肝细胞坏死主要为程序性坏死，程序性坏死是受体相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)家族所介导的，RIP1和RIP3相互结合，促进细胞由凋亡转换至坏死，引起细胞程序性坏死[7]。有研究表明RIPK1[8]以及RIPK3[9]参与APAP诱导的肝坏死，同时研究表明APAP通过活化RIPK1进一步激活JNK引起肝细胞坏死[8]，然而RIPK1通过什么机制激活JNK并不清楚，并且RIPK1以及RIPK3是否参与APAP肝损伤目前仍然存在争议[8-9]。

1.4无菌性炎症坏死的肝细胞释放DAMP，包括高迁移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein,HMGB1)、核DNA、热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)、角蛋白18(keratin 18,K18)，激活先天固有免疫系统，引起肝内无菌性炎症反应，释放细胞因子和趋化因子，趋化单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞到达损伤部位，加重损伤并促进再生修复[10-11]。而炎症小体在APAP肝损伤的作用机制目前还存在争议[12]，尚需进一步研究。

2 PPARα在APAP肝损伤的作用

PPARα是配体激活的核受体，在代谢调节方面发挥重要的作用。PPARα主要表达于脂肪酸氧化代谢速率较高的组织如肝脏、心脏、骨骼肌、棕色脂肪组织以及肾脏，也可表达于免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞。PPARα调节脂代谢相关基因的表达，促进脂肪酸氧化，维持脂代谢平衡[13]；并具有抗炎和抗增殖效应[14]。临床上PPARα激动剂用于治疗高三酰甘油血症和低密度脂蛋白胆固醇的血脂异常[15]。

2.1PPARα并不参与调节APAP肝脏代谢活化

利用PPARα激动剂研究证实PPARα促进多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein)Mrp3和Mrp4的表达从而保护APAP肝损伤，但并不影响APAP代谢，NAD(P)H:醌氧还酶1 (NQO1)、NAPQI以及UGT酶的活性均无显著改变[16]。PPARα全基因敲除小鼠动物实验的结果亦证实PPARα并不通过影响APAP代谢活化而保护肝脏[17]。

2.2PPARα是否通过磷酸化参与调节APAP诱导的氧化应激尚需验证通过液相色谱质谱技术(liquid chromatograph mass Spectrometer,LC-MS)代谢组学研究以及动物实验结果证实PPARα通过诱导靶基因线粒体解偶联蛋白2 (Uncoupling protein 2,UCP2)的表达，降低JNK，c-jun、H2O2的水平，同时增加线粒体GSH水平，进而抑制APAP诱导的线粒体脂肪酸β氧化即氧化应激水平，从而保护肝细胞[18]。但也有其他机制研究结果显示APAP模型抗氧化基因的表达下调，氧化应激增加，但PPARα及其靶基因Angptl4以及Mcad的表达没有变化[19]。以上研究结果并不统一，PPARα在蛋白水平如何调节APAP肝损伤亦需进一步研究证实。

PPARα蛋白活性受磷酸化调节，而ERK、p38-MAPK、PKA、PKC以及GSK3等均可调节PPARα磷酸化[20]。研究表明在APAP肝损伤中，NAPQI诱导早期氧化应激，激活GSK3β以及MLK3，随后通过MKK4/7激活JNK，激活的 pJNK随后转位入线粒体，引起线粒体膜通透性转换MPT，线粒体外膜肿胀裂解，促进凋亡诱导因子AIF以及EndoG释放，随后EndoG入核，促进肝损伤[21-22]。2016年Christian Trautwein等[23]证实在小鼠和人类急性及慢性毒性肝损伤模型以及小鼠APAP诱导急性肝损伤模型(APAP 500 mg·kg-1,IP,8h)中，肝细胞中JNK1和JNK2联合作用，通过JNK-JunD依赖性通路、MAPK通路保护肝损伤。但是否上述激酶通过磷酸化PPARα发挥作用以及PPARα是否通过抑制线粒体氧化应激干扰线粒体膜势能，从而干扰JNK1以及JNK2的作用，最终调节APAP肝损伤仍旧需要进一步研究来阐明。

2.3PPARα是否参与调节APAP肝脏炎症尚无定论炎症细胞明确参与了APAP肝炎症损伤过程，但炎症细胞中表达的PPARα是否参与APAP损伤过程目前尚不清楚。Holland,Ricky D等采用基因表达谱分析方法证实Vanin1在APAP诱导的肝脏炎症中发挥重要作用[24]。随后有研究发现Vanin1敲除C57BL/6鼠肝细胞增殖减少(PCNA阳性肝细胞减少)，F4/80阳性巨噬细胞浸润减少和异常分布，同时炎症细胞因子TNF-α、CCl2、iNOS以及IL-4的表达降低，肝脏局部Gr1以及CD11b阳性的炎性细胞减少，从而坏死细胞清除减少，APAP肝损伤加重。但是Vanin1对GSH含量、APAP代谢酶以及APAP生物解毒并没有影响[25]。因此，Vanin1与炎症细胞中表达的PPARα是否相关、PPARα是否参与APAP诱导的肝脏炎症反应尚无定论。

2.4PPARα参与APAP肝损伤晚期再生修复研究表明PPARα敲除鼠给予PHx手术后肝再生延迟，同时PPARα可以增加细胞增殖以及降低凋亡，促进肝再生[26-27]，有助于损伤肝组织的修复。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠APAP肝损伤模型研究结果也显示NASH小鼠通过降低细胞分裂和组织修复，下调PPARα的表达从而促进APAP肝损伤；给予非诺贝特饮食后减轻APAP肝损伤，说明PPARα通过促进肝再生从而减轻NASH小鼠APAP肝损伤[28]。美国路易斯安那大学药理毒理学系Mehendale,HM等于2003年在链脲霉素糖尿病鼠(STZ-DB)模型中也发现PPARα敲除小鼠的肝脏S期DNA合成以及PCNA水平明显降低，说明其肝组织再生能力减弱。进一步的基因芯片分析表明与PPARα null-DB鼠相比，WT-DB鼠细胞氧化/应激/DNA损伤基因Gadd45、GADD153、EGR1、HO-1水平明显下调，促进APAP排泄的P450酶基因Cyp4a10,4a14上调。CyclinD1、 p38 MAPK、Cdk6的表达上调，NF-κB明显激活，提示PPARα亦可能在参与干细胞再生修复的同时还参与转录后水平的调节[29]。

既往大量研究证实P38应激激活蛋白激酶参与调节细胞生长、分化、增殖、凋亡以及炎症和应激反应；而P38可以磷酸化PPARα A/B结构域中的Ser 6，12和/或21，活化PPARα；动物实验结果显示PPARα敲除小鼠检测p38 MAPK表达降低[30]。但是否APAP通过下调P38 AMPK，从而抑制PPARα磷酸化，抑制细胞增殖，促进肝损伤仍需要进一步研究。PPARα调节APAP肝再生的具体机制尚不十分清楚。

3 总结与展望

PPARα是关键的代谢调控因子，在转录水平作为核受体转录因子，具有调节脂肪酸代谢、细胞周期及炎症基因表达的作用，在蛋白水平还可受磷酸化调节。由于目前应用的是PPARα全基因敲除小鼠模型，可能存在机体脂质代谢紊乱继发氧化应激的混杂因素存在，影响研究结果的准确性，也造成目前相关研究结果不一致的原因之一。另外，由于PPARα激动剂非诺贝特可引起急性以及持续的血肌酐水平的升高，且药物蓄积引起肌病的风险较高，临床需要更安全的靶向PPARα的药物研发。未来希望能够采用细胞特异性PPARα敲除模型，明确PPARα对于APAP肝损伤的特异性作用机制，帮助研发有效的靶向药物，挽救并逆转临床药物性肝损伤患者疾病进程。