GRAS真菌好食脉孢霉固态发酵醋糟产类胡萝卜素的优化

■ 邓永平 艾瑞波 刘晓兰 佟佳潞 辛嘉英 郭建华

(1.齐齐哈尔大学食品学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省普通高校农产品深加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.哈尔滨商业大学省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

类胡萝卜素是重要的可食用色素之一，具有多种生理功效，在食品、药品及饲料添加剂等领域需求量较大[1-3]。获得类胡萝卜素的常见途径包括从果实或蔬菜中提取、化学合成、微生物合成。从果蔬中提取工艺复杂、成本高、受季节限制并着色能力差；化学合成色素的毒性问题越来越受人们关注，一些化学合成类胡萝卜素，包括虾青素，已经被发现有害并且禁止从药店销售[4-5]；微生物来源的天然类胡萝卜素具有生产成本低、易实现工业化的优点而受到科研工作者的青睐。目前已从一些藻类、真菌和细菌代谢产物中获得了类胡萝卜素，如来自杜氏藻（Dunaliella）、雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）、三孢布拉霉（Blakeslea trispora）、粗壮脉纹孢菌（Neurospora crassa）、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、红球菌属（Rhodopila）、红螺菌属（Rhodospirillum）的类胡萝卜素已见报道[6-12]。为了降低类胡萝卜素生产成本，许多工农业副产品，如玉米浆、咖啡渣、麦麸、小麦秸秆和糖蜜等都被用作微生物发酵法生产类胡萝卜素的培养原料[13-17]。

好食脉孢霉（Neurospora sitophila）是遗传学和生物化学研究中非常重要的模式生物，是FDA组织认证的安全菌株之一（GRAS，Generally Recognized as Safe），生长速率快[18]。前期研究发现，分离自北方传统发酵食品的好食脉孢霉（Neurospora sitophila，CGMCC No.1836）可以利用醋糟固态发酵产类胡萝卜素[19]，为了提高类胡萝卜素产量和醋糟的利用价值，本文对固态发酵培养基及培养条件进行了优化。

1 材料和方法

1.1 菌种

好食脉孢霉（Neurospora sitophila），保藏号CGMCC No.1836。

1.2 试剂和仪器

醋糟，齐齐哈尔市黑龙酿造有限责任公司；麸皮；市售；盐酸、丙酮等试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。YXQ-SG46-280S压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司；Himac CF15RX冷冻离心机，日立(中国)有限公司；PYX-DHS·350-BS-Ⅱ隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；50i正置光学显微镜，尼康仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 斜面培养

斜面培养基为PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）（w/v）：马铃薯20%、琼脂2%、葡萄糖2%，自然pH值。将菌体接种至斜面培养基中，28～30℃培养3～5 d。

1.3.2 固态发酵

在250 ml三角瓶中装入5 g醋糟，其它原料及配比根据试验确定。灭菌后接入好食脉孢霉孢子悬液，接种量为每克干物质培养基接入1×106个孢子。

1.3.3 发酵产物处理

培养结束后将发酵产物置于45℃干燥至恒重。

1.3.4 固态发酵培养基组分的研究

①氮源种类和添加量的确定

250 ml三角瓶中加入5 g醋糟，添加醋糟量1%的氮元素（氮素来源分别为玉米黄粉、麸皮、豆粕、干豆渣、硫酸铵），按照各个氮源含氮量计算加入氮源质量，料水比1∶3，培养基pH值约5.5，接入1×106个孢子/g干基，28℃光照培养72 h后测定类胡萝卜素含量。将上述试验确定的氮源的添加量调整为0%、1%、2%、3%、4%（按照氮素含量占醋糟比重算），其它条件不变，测定类胡萝卜素含量。

②培养基料水比的确定

250 ml三角瓶中加入5 g醋糟和醋糟量2%的干豆渣，分别按照料水比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5向培养基中加入蒸馏水，培养基pH值约5.5，接入1×106个孢子/g干基，在28℃光照培养72 h后测定类胡萝卜素含量。

③诱导物及其添加量的确定

250 ml三角瓶中加入5 g醋糟，添加醋糟量2%的干豆渣，再分别加入干基量0%、4%、8%、12%、16%的浓度为5%的番茄汁和5%胡萝卜汁，调整料水比1∶3，培养基pH值约5.5，接入1×106个孢子/g干基，在28℃光照培养72 h后测定类胡萝卜素含量。将上述试验确定的诱导物的添加量设置为醋糟量的0%、4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%（v/w），其它条件不变，测定类胡萝卜素含量。

1.3.5 正交试验优化培养条件

采用L9(34)正交试验设计优化培养条件，试验因素分别为培养基初始pH值（A）、培养时间（B）、培养基温度（C），选取三个水平进行试验（见表1）。

表1 正交试验因素及水平

1.3.6 类胡萝卜素含量的测定

称取1 g干燥后发酵产物置于50 ml小烧杯中，加入10 ml 1 mol/l的HCl，常温振荡1 h，取出沸水浴5 min，迅速冰浴冷却至室温。

将破壁处理后的孢子液转移至离心管中，7 000 r/min，4℃的条件下离心10 min除去HCl，并用蒸馏水洗涤，在7 000 r/min，4℃的条件下离心10 min，倾倒去掉上清液，加入适量蒸馏水水洗并离心，弃去上清液。加入20 ml丙酮萃取，在7 000 r/min，4℃的条件下离心10 min，收集上清液，用丙酮重复提取，直至上清液无色。用未接菌的醋糟培养基作为对照，在455 nm下测吸光度。根据公式计算类胡萝卜素质量。

式中：B——单位质量发酵饲料中类胡萝卜素质量(μg/g);

Aλmax——最大吸收波长455 nm处的吸光度；

D——测定试样的稀释倍数；

V——提取色素有机溶剂体积（ml）；

m——干饲料质量（g）；

0.16 ——类胡萝卜素的摩尔消光系数。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2003和正交助手软件对数据进行统计分析，所有试验均重复三次，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与讨论

2.1 氮源种类和添加量的确定

按照各个氮源含氮量计算加入氮源质量，氮源添加量见表2，氮源对类胡萝卜素产量的影响见图1。

表2 五种氮源含氮量及添加量

图1 氮源对类胡萝卜素产量的影响

类胡萝卜素主要存在于好食脉孢霉孢子中，该菌在不同的氮源中生长时形成孢子的时间和孢子量不同，因而类胡萝卜素的含量也会随之而异。由图1可知，在干豆渣作为氮源时，好食脉孢霉产类胡萝卜素的产量最高；麸皮做氮源时，类胡萝卜素产量略低于干豆渣；玉米黄粉、豆粕、硫酸铵作为氮源时类胡萝卜素产量均较低。玉米黄粉、豆粕、硫酸铵的氮含量均高于干豆渣和麸皮，从培养特征分析，有利于菌丝快速生长，但是不利于孢子形成，因此，选择干豆渣作为氮源，类胡萝卜素含量为29.06 μg/g。

培养基中干豆渣的添加量对类胡萝卜素的产量影响见图2。

图2 氮源浓度对类胡萝卜素产量的影响

由图2可知，不同的干豆渣添加量对类胡萝卜素产量有不同影响，浓度过低时产类胡萝卜素含量较低，浓度为2%时类胡萝卜素含量最高，浓度再增大反而使类胡萝卜素的产量降低。可能是因为当浓度低时，不足以提供菌体生长所需的营养成分，氮源浓度增高，更适合霉菌菌丝的生长，使得菌丝生长旺盛，孢子产量低，而导致类胡萝卜素产量不高。因此，确定干豆渣添加量为醋糟加量的2%。

2.2 培养基料水比的确定

好食脉孢霉为好氧菌，对于固态发酵培养基的含水量要求较高。培养基中水分过多，不利于氧气流通；水分太少，会导致某些营养成分难以呈溶解态被菌体利用。水分过多或过少均会影响菌体代谢和生长，从而影响类胡萝卜素产量。培养基料水比对好食脉孢霉固态发酵产类胡萝卜素的影响见图3。

图3 加水量对类胡萝卜素产量的影响

如图3所示，水分对类胡萝卜素产量的影响较大，含水量为15 ml时，类胡萝卜素产量最高。随着培养基含水量增加培养基状态呈黏稠状，不利于好氧菌生长，使类胡萝卜素产量迅速下降。因醋槽为5 g，所以确定料水比为1∶3时，类胡萝卜素产量最优。

2.3 诱导物的种类及浓度确定

通过添加类胡萝卜素前体物质如番茄红素等诱导物，可以提高微生物源类胡萝卜素的产量[20-21]。诱导物的筛选结果见图4。

图4 诱导物对类胡萝卜素产量的影响

由图4可知，培养基中添加番茄汁和胡萝卜汁均能诱导类胡萝卜素产量的提高，其中添加16%的浓度为5%的番茄汁对类胡萝卜素产量的提高效果最好。番茄汁中含有番茄红素及其前体物质，有助于促进类胡萝卜素的合成代谢[22]。

培养基中添加不同浓度的番茄汁对类胡萝卜素的产量影响见图5。

图5 番茄汁添加量对类胡萝卜素产量的影响

由图5可知，在培养基中添加16%的浓度为5%番茄汁有助于提高类胡萝卜素的产量，使之较对照产量提高，继续增加番茄汁添加量导致类胡萝卜素产量下降，可能是某些中间产物过量导致的类胡萝卜素合成代谢过程酶反馈调节有关。

2.4 培养条件的优化

对好食脉孢霉产类胡萝卜素的发酵条件进行了优化，试验结果见表3和表4。

表3 L9(34)试验结果

表4 方差分析结果

如表3所示，分析极差可知培养条件最优组合为A2B2C3，即初始pH值5.5、培养温度28℃、培养时间120 h。根据极差判断影响产酶因素的主次顺序依次为B＞A＞C，即培养温度＞初始pH值＞培养时间。方差分析结果见表4。

由表4可以看出，培养温度显著影响类胡萝卜素的产量，培养基的初始pH值和培养时间对类胡萝卜素的产量影响不显著。

经过发酵试验验证该工艺条件较稳定。最终确定产酶条件为：250 ml三角瓶装5 g醋糟，2%干豆渣（与醋糟量比），料水比1∶3，添加16%的浓度为5%番茄汁，培养基pH值为6.5，在28℃培养120 h，优化后类胡萝卜素的产量达到45.32 μg/g，较优化前提高了约1.56倍。

3 结论

固态发酵（SSF）可以减少能耗和水消耗，减少环境污染[23-24]。本文对好食脉孢霉固态发酵醋糟生产类胡萝卜素的培养条件进行了研究，通过单因素试验和正交试验确定：250 ml三角瓶装5 g醋糟，2%干豆渣（与醋糟量比），料水比1∶3，添加16%的浓度为5%番茄汁，培养基pH值为6.5，在28℃培养120 h，优化后类胡萝卜素的产量达到45.32 μg/g，较优化前提高了约1.56倍。通过优化提高了好食脉孢霉固态发酵醋糟生产类胡萝卜素的产量。

醋糟是酿醋后的副产品，年产量巨大。醋糟含水量极高(约70%)，蛋白质含量低(6%～12%)，粗纤维含量高(15%～35%)，而且pH值较低，不易降解，直接排放易造成环境污染[25]。因此，醋糟的有效利用一直是研究人员关注的问题。通过本文的研究可为醋糟的再利用提供新途径，也为高附加值的类胡萝卜素提供了新的廉价生产方式。