壳寡糖对断奶仔猪生长性能、血清抗氧化指标及肠道微生物菌群的影响

■ 刘媛媛 冯秋月 张旭强 李 康 王安如 曹廷锋 闫 雪*

（1.北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室，北京 100192；2.北京市饲料安全生物调控工程技术研究中心，北京 100192；3.山东卫康生物医药科技有限公司，山东临沂 276016）

壳寡糖（β-1,4-寡糖-葡萄糖胺）又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是壳聚糖经特殊的生物酶技术降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量≤3 200 Da，是水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。近年来，壳寡糖的诸多生理活性已被广泛研究，壳寡糖分子带有活性氨基基团，而且可被动物直接吸收释放到血液中并作用于靶细胞，在提高机体抗氧化能力方面发挥着重要作用[1]，壳寡糖可被巨噬细胞内吞[2]，刺激巨噬细胞产生多种细胞因子和活性氮氧化物[3]。壳寡糖的许多性质，例如聚合度、脱乙酰化度、电荷分布以及对分子的化学修饰都会强烈影响到其表观生物活性[4]，因而壳寡糖也越来越多被应用于饲料当中，并表现出抑菌性、抗氧化和清除体内自由基等不同的生理活性[5-13]，提高养殖经济效益。仔猪在断奶时会出现不同程度的生长障碍，例如仔猪被毛粗乱、不吃料、消瘦甚至出现死亡等现象，但目前壳寡糖在鸡上（包括肉仔鸡和蛋鸡）的应用研究相对比较深入[14-22]，在仔猪上应用报道很少，同时由于壳寡糖产品的不均一性，其聚合度和脱乙酰度影响了壳寡糖产品功能的多样性，因此本试验考察了壳寡糖不同添加量对断奶仔猪生长性能、血清抗氧化指标及肠道微生物菌群的影响，旨在改善仔猪在断奶时的应激，也为壳寡糖在仔猪的应用研究上提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 试验材料

壳寡糖：聚合度2～10，相对分子质量≤2 000 Da，纯度为80%，脱乙酰度为90%，由山东卫康生物医药科技有限公司提供。

1.2 试验动物及日粮

试验动物选用“杜×长×大”三元杂交猪，基础日粮配方及营养水平参考范彧等[23]。

1.3 试验设计与饲养管理

试验在唐山大北农猪育种科技有限责任公司动物试验场进行，选取300头(6.71±0.19)kg“杜×长×大”健康的28日龄断奶仔猪，根据“胎次一致、品种相同、体重相近、公母各半”的原则随机分成5个处理，每个处理6个重复，每个重复10头猪。其中A组为对照组，饲喂玉米-豆粕型基础日粮，试验组（B、C、D、E）在基础日粮中分别添加不同剂量的壳寡糖，添加水平见表1。仔猪自由采食和饮水，试验进行35 d。

1.4 样品采集与检测

1.4.1 生产性能的测定

试验开始、第14 d和第35 d结束时对猪进行空腹称重，试验期间每天记录采食量，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。同时统计腹泻率。

表1 不同剂量壳寡糖试验分组

1.4.2 血清抗氧化指标测定

试验第14 d和第35 d，空腹前腔静脉采集血液，分离制备血清，保存于-80°C冰箱中待测。血清中总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及丙二醛（MDA）含量的检测采用试剂盒方法，试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。

1.4.3 粪便微生物的测定

断奶后试验开始前，第0 d、第14 d和第35 d采集仔猪粪便。与当天饲喂前用干净竹签从自然排出的粪便深处采集样品。称取0.2 g粪便样品，采用天根粪便基因组DNA提取试剂盒要求提取基因组DNA，-20℃保存备用。利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）与16S rDNA测序分析微生物组成结构，参照曾燕等[24]方法进行样品细菌的PCR-DGGE。回收DGGE图谱上的共性条带和特异性条带，进行克隆测序。DGGE凝胶图采用Quantity One(Bio-Rad)凝胶定量软件进行图谱分析。测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对，并进行聚类分析和相似性分析。

1.5 数据统计分析

数据采用SAS 8.0程序GLM过程进行统计分析，多重比较采用邓肯氏法（Duncan's），以P＜0.05为显著水平，P＜0.01为差异极显著，P＜0.10为讨论趋势。

2 结果与分析

2.1 不同剂量壳寡糖对断奶仔猪生长性能的影响(见表2)

由表2可知，与对照组（A组）相比，C组和E组提高了断奶仔猪15～35 d和0～35 d这两个阶段的平均日增重，并且降低了料重比（P＜0.05）；而B组则明显使这两个阶段的平均日增重降低，显著提高了料重比（P＜0.05）；但是各试验组对0～14 d阶段的平均日增重、采食量以及料重比没有显著影响（P＞0.05）。B组和C组有效降低了断奶仔猪的腹泻率，D组和E组则提高了断奶仔猪的腹泻率。

表2 不同剂量的壳寡糖对断奶仔猪生长性能的影响

2.2 不同剂量的壳寡糖对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响(见表3)

由表3可知，与对照组（A组）相比，在0～14 d阶段C组有提高血清中总抗氧化能力（T-AOC）的微弱趋势，其它试验组则呈现少许降低血清中总抗氧化能力（T-AOC）的趋势；C组和D组显著提高0～14 d阶段血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量（P＜0.05），B组和E组也有一定程度提高。0～35 d阶段，只有C组显著提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量，其它试验组对所检测的抗氧化指标并无影响。

表3 不同剂量的壳寡糖对断奶仔猪血清中抗氧化相关指标的影响

2.3 不同剂量的壳寡糖对断奶仔猪粪便微生物多样性的影响

2.3.1 仔猪断奶后饲喂不同剂量壳寡糖14 d的粪便DGGE检测结果（见图1）

样品经16S rDNA V3区PCR扩增后进行DGGE分离。在PCR-DGGE图谱(图1)中，条带亮度与该菌株含量成正比，深色条带为该样本中的优势菌。通过图谱聚类分析及样品相似度结果（见图1、图2、图3）显示A组、B组、C组和E组聚类明显，由于动物个体差异较大造成聚类不明显，其他组没有明显聚类现象。通过标记条带测序结果分析可见：断奶后试验开始前的对照组中，1号Uncultured bacterium（不可培养细菌）数量相较于其它处理组数量较多，而2号Uncultured bacterium（不可培养细菌）数量较少；B组、C组、D组以及E组中，3号Uncultured bacterium（不可培养细菌）数量较多，并且4号Prevotella marshii（普氏菌属）的数量相较于试验开始前的对照组较高（见图1、表4）。

2.3.2 仔猪断奶后饲喂不同剂量壳寡糖35 d的粪便DGGE检测结果

通过图谱聚类分析及样品相似度结果（见图4、图5、图6）显示E组聚类明显，其他组没有明显聚类现象。通过标记条带测序结果分析可见：仔猪断奶后试验开始之前的对照组中，1号Uncultured bacterium（不可培养细菌）、2号Uncultured bacterium（不可培养细菌）以及3号Gemmiger formicilis（吉米菌属）数量较多；饲喂壳寡糖35 d的B组及C组仔猪粪便中，4号Prevotella copri（普氏菌属）数量相对较高；C组中，5号Papillibacter cinnamivorans数量相较于其它各处理组较高；而D组中，6号Clostridium aurantibutyricum（金黃丁酸梭菌）数量相对较高（见图4、表5）。

3 讨论

图1 试验第14 d各组仔猪的粪便DGGE图谱

图2 试验第14 d各组仔猪粪便DGGE图谱聚类分析结果

图3 试验第14 d各组仔猪粪便DGGE图谱样品相似度结果

表4 试验第14 d各组仔猪粪便DGGE图谱中标记条带测序结果

本试验证明添加适量壳寡糖可有效降低断奶仔猪的腹泻率，对0～14 d的平均日增重、采食量以及料重比没有显著影响，但可提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶（SOD）含量；降低了15～35 d和0～35 d这两个阶段的料重比，对此阶段的抗氧化指标并无显著影响，饲喂壳寡糖14 d，各组粪便的微生物组成差异并不明显。饲喂壳寡糖35 d，添加壳寡糖使粪便中能产生甲酸、丁酸、乙酸的Gemmiger formicilis[25-26]（甲酸芽殖菌）数量减少；B、C组引起肠道炎症Prevotella copri[27]（普氏菌属）的数量增加；但是C组粪便中可将肉桂酸转化为苯甲酸Papillibacter cinnamivorans[28]的有益菌增多；D组粪便中有益菌Clostridium aurantibutyricum[29]（金黃丁酸梭菌）增多，该菌可水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、醋酸和乳酸。因此，壳寡糖的添加在有效抑制有害菌生长方面效果并不明显，且几乎未影响断奶仔猪粪便微生物组成结构与多样性。

图4 试验第35 d各组仔猪的粪便DGGE图谱

图5 试验第35 d各组仔猪粪便DGGE图谱聚类分析结果

图6 试验第35 d各组仔猪粪便DGGE图谱样品相似度结果

表5 试验第35 d各组仔猪粪便DGGE图谱中标记条带测序结果

壳寡糖阶段性作用比较明显，这与他人研究一致，党国旗等[10]探讨壳寡糖对断奶仔猪生产性能、营养物质利用率及健康状态的影响发现，日粮中添加100、150 g/t壳寡糖可显著提高日增重7.93%、14.02%；显著降低料重比11.02%、12.27%；腹泻率分别下降40.04%、54.78%；王秀武等[11]研究表明日粮中添加200 mg/kg壳寡糖可显著提高35日龄和70日龄仔猪体重；张玲等[12]也研究发现日粮中添加壳寡糖可极显著缓解应激仔猪日增重的降低、极显著改善饲料转化率；龙次民等[13]则将壳寡糖实验应用于妊娠85 d的母猪上，结果壳寡糖可提高新生仔猪体内抗氧化酶活性及其上游调控基因的表达，提高仔猪抗氧化力。但由于市场上壳寡糖聚合度和脱乙酰度等的不同，生理活性会产生不同的影响，加之壳寡糖在断奶仔猪的应用上还未深入，因此应系统加深相同聚合度或者相同脱乙酰度的壳寡糖的研究，规范壳寡糖使用添加，本试验中高剂量的壳寡糖有提高断奶仔猪腹泻率的趋势。壳寡糖在肉仔鸡、蛋鸡上的作用效果显著，王秀武等[14]研究发现日粮添加0.1%壳寡糖可显著提高肉仔鸡增重(P＜0.05)，8周龄体重比对照组提高18%，料重比较对照组降低3.4%，同时[15]还以1日龄肉仔鸡作为试验对象，随壳寡糖添加剂量增加各周龄平均体重增加，7周龄出栏时壳寡糖组（125 g/t）平均体重增加140 g，提高5.85%，料重比降低3.93%；孟晓[16]选用58周龄蛋鸡进行试验，结果表明蛋鸡日粮中添加不同水平的壳寡糖（分子量1 kDa）对蛋鸡的料蛋比、平均日采食量和平均蛋重均无显著性差异，添加300 mg/kg壳寡糖显著提高了蛋鸡的产蛋率；闫冰雪[17]选用1日龄白羽鸡进行相关研究，结果表明基础日粮中添加300 mg/kg壳寡糖显著提高了1～42 d体增重及前期（1～21 d）和全期（1～42 d）的耗料量，分别比对照组提高了15.929%（P＜0.05）和 13.819%（P＜0.05）、14.191%（P＜0.05）；壳寡糖阶段性效果显著，与本试验结果相同。日粮中添加适宜剂量壳寡糖可提高仔猪生长性能，改善饲料转化率，并提高仔猪健康水平。

4 结论

在对断奶仔猪生产性能的影响上，C组和E组效果较好，提高了饲料转化率大约为4%～5%左右，且添加时间在15～35 d阶段效果显著。B组降低断奶仔猪腹泻率高达28%，C组降低腹泻率60%。试验14 d，C组对提高血清中总抗氧化能力（T-AOC）上稍有作用，C组和D组大大提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量；试验35 d，C组显著提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。饲喂壳寡糖35 d，添加壳寡糖使粪便中能产生甲酸、丁酸、乙酸的Gemmiger formicilis（甲酸芽殖菌）数量减少；C组粪便中可将肉桂酸转化为苯甲酸Papillibacter cinnamivorans的有益菌增多；D组粪便中有益菌Clostridium aurantibutyricum（金黃丁酸梭菌）增多。

综合以上分析结果，壳寡糖添加量在0.5 g/kg饲料时，可以有效提高断奶仔猪的饲料转化率和降低腹泻率，并提高血清中抗氧化酶活性。且壳寡糖在添加前期主要体现在抗氧化作用方面，添加后期主要体现在提高生产性能方面。