针灸预处理对胃黏膜损伤大鼠胃黏膜微循环相关因子一氧化氮、内皮素的影响

霍新慧，智 勇，赫吉铭，郭梓杰，冯逸杰，热爱拉·加纳提

（新疆医科大学中医学院针灸基础教研室，乌鲁木齐 830054）

随着人们预防观念的逐渐加强，“治未病”成为研究的热点，针灸预处理在中医对胃黏膜损伤“治未病”方面疗效显著[1-2]。胃黏膜损伤（Gastric mucosal lesions，GML）常见的发病原因有物理性、化学性（如饮酒、药物）、精神性刺激，和细菌或其毒素等因素。胃黏膜损伤的临床表现是一系列的程序化的损伤反应，主要表现为胃黏膜充血、糜烂、水肿、坏死和脱落，以及浅表性溃疡。针灸预处理是通过适度针灸预处理相关腧穴，以发挥其扶助正气、激发经气的作用，并激发一系列胃黏膜自身保护机制的作用与潜力，从而发挥其防治疾病的效应。

本研究以胃黏膜损伤指数（UI）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和内皮素（endothelin，ET）的表达为指标，探讨针灸预处理对胃黏膜损伤的保护作用及与NO、ET的关系，并将针预处理和灸预处理做比较，研究二者对急性胃黏膜损伤的保护作用，并探讨其对胃黏膜微循环的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD大鼠40只，3～4月龄，空腹体质量（200±50）g，雌雄各半，新疆医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（新）2016-0003，饲养于新疆医科大学实验动物中心SPF级实验动物房，屏障来源证号：NO.65000700000749。饲养温度22～25 ℃，相对湿度40%～60%，自然明暗周期，实验期间大鼠自由饮水和进食，适应性饲养1周后进行实验，实验过程中动物处置方式符合动物伦理学标准。

1.2 仪器与试剂 半自动轮转石蜡切片机（金华市科技有限公司，H3315），TG16-WS高速台式离心机（常州市万丰仪器制造有限公司），JJ-2组织捣碎匀浆机（常州市金坛新航仪器厂） ，lympus Bx-70 显微成像系统（日本OLYMPUS公司）。ELISA试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。

1.3 大鼠分组及处理 将大鼠编号，按随机数字表法随机分为4组，每组10只。1）正常组：鼠架束缚，30 min/次，1次/d，连续7 d；2）模型组：鼠架束缚，30 min/次，1次/d，连续7 d；3）针预处理组：鼠架束缚，毫针刺中脘、足三里（双），30 min/次，1次/d，持续7 d；4）灸预处理组：鼠架束缚，温和灸中脘、足三里（双），30 min/次，1次/d，持续7 d。各组大鼠每次处理后松绑，回笼正常饲养，连续处理7 d，第8天大鼠禁食不禁水，第9天模型组、针预处理组和灸预处理组制作急性胃黏膜损伤模型。

1.4 腧穴定位 腧穴定位依据《实验针灸学》[3]常用动物穴位定位法确定。中脘：脐上约20 mm，足三里：取双后肢膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处。

1.5 针灸方法 大鼠固定于自制鼠架上，定穴后局部剪毛。毫针刺选用0.25 mm×13 mm的毫针（苏州针灸用品有限公司），进针深度5 mm，平补平泻法，每10 min行针1次（上午10: 00开始），1次/d，每次30 min，连续治疗7 d。灸法选用温和灸，将温灸纯艾条（南阳卧龙汉医艾绒厂，规格4 mm×120 mm）固定于改良后的艾条悬灸支架上，使艾条点燃部位垂直距离大鼠穴位或者非穴对照点约2 cm，3个穴位同时施灸，30 min/次，1次/d，上午10: 00开始连续灸治7 d。1.6 模型制备 采用无水乙醇灌胃法[4-5]：各组大鼠在灸预处理7 d之后，禁食不禁水24 h后进行无水乙醇灌胃，正常组采用生理盐水灌胃，按照每只大鼠0.6 mL/100 g无水乙醇剂量灌入相应剂量，为防止大鼠胃黏膜损伤后的自愈，1 h后按照2 mL/只阿司匹林混悬液进行灌胃，连续3 d。

1.7 指标检测

1.7.1 胃黏膜损伤指数（UI） 末次给药后，大鼠禁食24 h，禁水8 h，腹腔麻醉（10%水合氯醛0.35 mL/100 g）后立即剖腹， 所有大鼠摘下全胃，沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗，将胃平摊在滤纸上，用放大镜肉眼观察进行UI的评定。按GUTH法[6]计算：将用冰生理盐水冲洗干净过的胃组织在滤纸上平展开，10倍放大镜下用直尺肉眼观察评估：损伤≤l mm（包括糜烂点）为1分；l mm＜损伤≤2 mm为2分；2 mm＜损伤≤3 mm为3分；3 mm＜损伤≤4 mm为4分；＞4 mm为5分；损伤宽度＞2 mm者计分加倍。每只大鼠的UI 等于胃黏膜各处糜烂的计分值的和。

1.7.2 胃组织NO、ET的测定 每组随机抽取5只胃组织称重，将剪碎的组织块（0.5～1 g）放入量好的冰水中（胃组织:冰生理盐水为1:9），用组织捣碎机10 000～15 000 r / min 研磨制成10%的胃组织匀浆，4 ℃低温（低温低速离心机）3 000 r/min 离心15 min，取上清液，- 20 ℃低温保存，酶免法检测胃黏膜组织匀浆中NO、ET的含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行分析，实验数据用均数±标准差（）表示。经正态性检验，符合正态分布者，多组计量资料比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐者用 LSD 和 SNK 法，若方差不齐者用Tamhane’s T2或 Dunnett’s T3法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察 正常组大鼠胃黏膜光滑，无充血、水肿、糜烂；模型组大鼠胃黏膜明显充血、水肿，可见不同程度的点状、片状和条索样糜烂、出血点及溃疡形成；与模型组比较，针预处理组和灸预处理组大鼠胃黏膜损伤面积明显减少，未见溃疡形成，可见部分点状出血，以及条索状糜烂；尤其是灸预处理组损伤程度最小，偶见少许点状糜烂，无出血及溃疡现象。

2.2 各组大鼠胃黏膜损伤指数（UI）的比较 与正常组比较，模型组、针预处理组和灸预处理组的UI指数明显升高（P＜0.01），说明造模成功；与模型组比较，针预处理组和灸预处理组UI指数明显降低（P＜0.01），说明针灸预处理能减轻胃黏膜损伤；与针预处理组比较，灸预处理组大鼠UI指数显著降低（P＜0.05），说明灸预处理足三里、中脘穴，相比针预处理更能显著减轻胃黏膜损伤。

表1 各组大鼠胃黏膜损伤指数（UI）的比较（ ，n = 10）

表1 各组大鼠胃黏膜损伤指数（UI）的比较（ ，n = 10）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与针预处理组比较，▲P＜0.05

组 别 UI正常组 0.66±0.69模型组 13.42±4.50##针预处理组 5.91±2.70##△△灸预处理组 3.62±2.54##△△▲

2.3 各组大鼠胃组织NO、ET的比较 与正常组比较，模型组、针预处理组和灸预处理组的胃组织NO含量明显降低（P＜0.01），ET含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，针预处理组和灸预处理组的胃组织NO含量明显升高（P＜0.01），ET含量明显降低（P＜0.01）；与针预处理组比较，灸预处理组大鼠的胃组织NO含量明显升高（P＜0.05），ET含量明显降低（P＜0.01）。说明灸预处理能显著改善胃黏膜血液循环，抵抗胃黏膜损伤，且灸预处理比针预处理作用更显著。

3 讨论

胃黏膜损伤是导致多种消化系统疾病的主要病理生理学环节，胃黏膜受到损伤因子一定程度的侵害时，可启动自身多层次的防御体系与修复机制[7]，即胃黏膜保护[8-9]，Wallace等人将该防御机制阐述为5个层次：粘液-碳酸氢盐-磷脂屏障、表面上皮细胞防御体系、胃黏膜微循环屏障、胃黏膜免疫细胞屏障、胃黏膜的自身修复。

表2 各组大鼠胃组织NO、ET含量的比较（ ，n = 10）

表2 各组大鼠胃组织NO、ET含量的比较（ ，n = 10）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与针预处理组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组 别 NO/（μg/g） ET/（pg/g）正常组 16.26±2.39 94.65±9.80模型组 9.17±0.68## 188.44±20.60##针预处理组 11.43±1.70##△△ 144.22±18.07##△△灸预处理组 12.85±0.64##△△▲ 113.6±13.87##△△▲▲

胃黏膜微循环屏障是一个复杂的、综合性的调节过程，主要的调控因素有神经调节、体液调节、血管自身调节、代谢性调节、体温调节等，血管舒张和收缩因子的失衡是其中重要因素之一。一氧化氮（nitric oxide，NO）是内源性血管舒张因子，作为一种重要的保护因子，可以有效的调节血管紧张性和内皮细胞连续性，从而扩张血管，改善胃黏膜血液循环，维持胃黏膜完整性，间接地参与调节胃的胃酸分泌，促进溃疡愈合[10-11]。内皮素（endothelin，ET）是一种内源性损伤因子，以自分泌和旁分泌的方式作用于靶细胞上的特异性受体，ET具有强烈的收缩血管作用，在胃黏膜损伤过程中通过收缩血管和增加渗出以减少循环血量来降低胃黏膜血流，从而减弱胃黏膜防御[12-13]。

中医根据患者临床表现，将胃黏膜损伤归为“胃脘痛”“嘈杂”“吐酸”“胃痞”等范畴，在治疗中注重“养”而非“治”，强调“治未病”，这与现代医学认为防治本病的关键点在于最大限度的激发胃黏膜自身保护机制的作用与潜力的思路不谋而合。

针灸作为中医治未病的重要手段，在机体未病或疾病尚未发生之前，预先选取某些腧穴进行针灸刺激，以激发经气，通过扶助正气以防止疾病的发生，减轻疾病对机体的损害[14]。

大量的临床研究已证实了针灸对胃黏膜的保护作用[5]，作为一种生理性温热刺激原，艾叶性“苦、温、辛”，归肝、脾、肾经，是治疗胃病的外用效药，灸预处理与针预处理和其他方法相比，在“治未病”，尤其是在预防胃黏膜损伤方面独具优势[1-2]。研究显示，灸法发挥对胃黏膜损伤的防治作用，是激发机体产生内源性保护物质，并启动一系列的保护效应：抗氧化、抗炎、抑制凋亡等抗胃黏膜损伤效应，以及损伤后胃黏膜细胞增殖、重建等[15]。

足三里是足阳明胃经的合穴、胃腑下合穴，诸多古籍记载了该穴在治疗脾胃病证中具有调理脾胃、补中益气的功效，是治疗胃腑病的首选腧穴，《四总穴歌》中首句即“肚腹三里留”。现代大量临床、机制研究的文献也证实了足三里是治疗消化系统疾病使用频次最多的穴位，具有促进胃动力、增加胃血流量、抑制胃酸分泌，和保护胃黏膜等功效[11]。此外，足三里是全身强壮要穴之一，常用灸法以提高机体防御疾病的能力。中脘是胃之募穴，八会穴之腑会，还是手太阳、少阳、足阳明、任脉之会。本穴适当胃的中部，具有和胃健脾、疏理中气之效。研究显示，治疗消化性溃疡最常用的是足三里配中脘的合募配穴[16-17]，各种证型及症状均取此两穴[18]，下合穴与募穴均擅于治疗腑病，临床上配伍使用可相互协调、增强疗效。

本研究结果显示，与针预处理比较，灸预处理可以明显减轻因无水乙醇灌胃造成的急性胃黏膜损伤，上调胃黏膜组织NO、下调其ET的表达，灸预处理的效应明显优于针预处理。提示灸预处理对胃黏膜损伤中胃黏膜微循环相关因子NO、ET有较好的调控作用，激发了胃黏膜保护机制[19-20]。