调节青少年特发性脊柱侧凸患者椎旁肌改变的关键微RNA

张 珂，姜 横，孟怡辰，周许辉

海军军医大学附属长征医院骨科，上海 200003

青少年特发性脊柱侧凸（AIS）是最常见的脊柱畸形，其病因未明［1］。椎旁肌的不平衡在AIS的发生和进展中具有重要作用［2］。有文献报道，AIS患者两侧椎旁肌的肌电活动和肌纤维类型存在差异，且与患者的侧凸角度进展相关［3］。本研究组前期通过影像学测量发现，AIS患者两侧椎旁肌的肌容积和脂肪浸润率不对称［4］。另有研究显示，AIS患者两侧椎旁肌褪黑素受体和转化生长因子-β信号通路相关分子表达不对称，但对于上述椎旁肌的复杂改变的分子机制仍鲜有报道［5-6］。

微RNA（miRNA）通过调控基因表达在多种生物过程中发挥重要作用［7］。研究显示，一些肌肉特异性miRNAs能调节肌肉的各项功能，包括成肌细胞增殖、分化、收缩性能和压力反应等［8-9］。另外，肌肉特异性miRNA也与心脏肥大、心力衰竭、心律失常、先天性心脏病和肌营养不良等肌肉相关性疾病密切相关［10-11］。因此，本研究欲探寻调节患者椎旁肌改变的关键miRNA及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月—2016年9月本院收治的汉族女性AIS患者30例。纳入标准：①AIS诊断明确；②侧凸Cobb角＞ 40°；③临床资料和影像学资料完整；④不伴椎间盘突出、峡部裂等其他脊柱疾病，既往无针对肌肉功能治疗史或其他脊柱手术史。所有患者均被告知研究内容并签署知情同意书。凹侧与凸侧椎旁肌组织为尽量远离电刀处理过的多裂肌组织500 ～ 1 000 mg（约黄豆大小），去除坏死组织和残留血渍后置入冻存管，并迅速置于液氮罐内保存。

1.2 影像学测量和临床数据

所有患者术前拍摄标准站立位脊柱全长正侧位X线片，测量侧凸Cobb角并记录顶椎位置。使用电子病历收集患者临床信息，包括手术年龄、月经初潮时间、是否进行过支具或牵引等治疗。

1.3 miRNA高通量测序

取其中3例在发病年龄、手术年龄、Lenke分型、角度大小、Risser征等参数相匹配的患者凹侧和凸侧椎旁肌组织，提取总RNA，测定RNA纯度与质量，在5’和3’端分别连接接头序列，形成带有接头的单链RNA，反转录生成RNA/DNA杂交链，PCR扩增构建small RNA-seq cDNA文库，采用illumina Hiseq测序平台（上海晶能生物有限公司，中国）单端测序模式进行高通量测序。

1.4 实时荧光定量PCR

取其余27例患者的椎旁肌组织，验证高通量测序的质量及差异miRNAs的表达情况。使用TRIzol（Invitrogen公司，美国）提取椎旁肌组织总RNA，用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo公司，美国）测定RNA浓度与纯度。采用SYBR GreenⅡ20 μL体系扩增miRNA。具体反应体系、反应程序根据试剂盒说明书设定（TaKaRa公司，日本），以U6 snRNA作为内参。实时荧光定量PCR反应条件：95℃起始激活3 min；95℃变性12 s、62℃退火40 s、72℃延伸45 s，40个循环；最终72℃延伸5 min。采用ΔCt法计算miRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析。两侧椎旁肌组织相关miRNA表达水平的比较采用配对样本的Wilcoxon符号秩检验。采用Pearson相关性分析对两侧miRNAs相对表达量的差值与患者临床信息（手术年龄、术前侧凸Cobb角）的关系进行分析，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

由miRNAs聚类热图（图1）可知，AIS患者凹侧和凸侧椎旁肌存在差异表达miRNA。共有18个miRNA表达有差异，其中凹侧较凸侧表达量增加的12个，增加倍数最大的是miR-424；凸侧较凹侧表达量增加的6个，增加倍数最大的是miR-517（表1）。

图1 AIS患者两侧椎旁肌组织差异miRNA聚类热图（n=3）Fig. 1 MiRNAs clustering thermal map of bilateral paraspinal muscles in AIS patients（n=3）

表1 AIS患者两侧椎旁肌miRNA表达差异Tab. 1 Differences in miRNAs expression between bilateral paraspinal muscles in AIS patients n=3

为验证高通量测序的质量和测序筛选获得差异miRNAs的表达情况，在27例AIS患者两侧椎旁肌组织中对测序结果中变化倍数最大的6个miRNA进行表达验证，分别为凹侧含量较高的miR-424、miR-433、miR-769和凸侧含量较高miR-516、miR-517、miR-495。目标miRNA的相对表达量（ΔCt）=Ct目标miRNA表达量-CtU6。实时荧光定量PCR结果显示仅miR-516、miR-517和miR-495的表达差异具有统计学意义（P＜ 0.05，图2）。

相关性分析显示，两侧椎旁肌miR-516相对表达量差值与患者发病年龄呈负相关（r=-0.452），miR-517相对表达量差值与侧凸Cobb角呈负相关（r=-0.378）。

图2 AIS患者两侧椎旁肌差异表达miRNA验证（n=27）Fig. 2 Veri fi cation of differential expression of miRNAs in bilateral paraspinal muscles of AIS patients（n=27）

3 讨 论

AIS患者侧凸角度有进展风险，目前临床上主要处理措施是佩戴支具预防角度进展，针对大角度的侧凸进行手术矫形。患者随访检查接受的辐射、高昂的手术费用和继发的心肺功能障碍造成了巨大的社会负担［12］。对AIS发生机制的深入研究有助于更好地为疾病的诊断、治疗甚至预防提供新思路。由于遗传异质性和缺乏合适可靠的动物模型，目前AIS的病因和病理机制尚未明确［13］。有学者认为，在AIS的发生和进展中，椎旁肌组织的代偿性功能能维持脊柱的稳定性，当肌肉力量不足时，椎体内在的旋转不稳定导致侧凸角度增大［2，14-15］。上述研究主要从功能学和形态学方面阐述AIS患者两侧椎旁肌的不对称，却未对产生这种改变的分子机制进行阐述。本研究通过RNA高通量测序发现AIS患者两侧椎旁肌miR-516、miR-517、miR-495存在差异表达，且miR-516的相对表达差值与患者手术年龄呈负相关，miR-517的相对表达差值与患者侧凸Cobb角呈负相关。

有研究报道，在凹侧椎旁肌表达升高的miR-495与骨骼肌的再生关系密切［16］。miR-495位于Gtl2-Dio3基因座［17］，Gtl2-Dio3编码的miRNA能抑制分泌型卷曲相关蛋白（sFRP）的分泌，后者是Wnt信号转导通路的抑制剂。动物实验表明Gtl2-Dio3编码的miRNA（包括miR-495）在再生MEF2A敲除肌组织中表达下调，导致sFRP的表达上调和Wnt信号通路的活性减弱［18］。因此，miR-495在MEF2A的调控下对Wnt信号转导的调节在骨骼肌的再生过程中发挥重要作用。

miR-516和miR-517共同位于C19MC基因簇内［19-20］。有研究表明，该基因簇内的miRNA在成体组织中的表达量均较小［21］，而在早期胚胎发育过程中显著高表达［22］。该基因簇内的miRNA的调控功能大多与肿瘤的发生相关［23］。目前miR-516和miR-517在骨骼肌发育或AIS的发生、发展过程中的作用尚未见报道。

本研究组前期发现AIS患者两侧椎旁肌的肌容积和脂肪浸润率不对称［4］，本研究结果提示两侧椎旁肌中与骨骼肌再生相关的miRNA表达存在差异，推测在应力或青春期各种内外因素的作用下，两侧椎旁肌的miRNA表达发生改变，异常表达的miRNA通过调控特异性靶基因的表达而引起肌细胞生长发育和其他功能的变化，导致两侧椎旁肌收缩性能出现差异，最终引起侧凸的出现或加重。miRNA在AIS患者两侧椎旁肌中差异表达的机制仍需进一步研究，以解释其介导椎旁肌不平衡改变的作用机制。