过氧化物酶体增生物激活受体激活物对ox—LDL诱导内皮细胞c—fos表达的影响

祝河忠 陈佳娟 童学影

摘 要：目的 观察过氧化物酶体增生物激活受体α激活物K877对氧化型低密度脂蛋白所诱导的人脐静脉内皮细胞c-fos基因表达的影响及机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞，采取氧化型低密度脂蛋白刺激，应用K877干预，逆转录聚合酶链反应检测c-fos基因的表达。结果 与对照组比较，氧化型低密度脂蛋白组c-fos基因表达增加（P<0.05）；与氧化型低密度脂蛋白组比较，K877组c-fos基因表达减少（P<0.05）；与K877组比较，K877联合多聚肌甘酸c-fos基因表达进一步下降（P<0.05）。结论 氧化低密度脂蛋白促进了人脐静脉内皮细胞c-fos基因的表达，过氧化物酶体增生物激活受体α激活物K877可抑制c-fos基因的表达，血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1参与了该过程。

关键词：内皮细胞；c-fos；氧化型低密度脂蛋白；过氧化物酶体增生物激活受体

中图分类号：R543.5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.20.017

文章编号：1006-1959（2018）20-0058-03

Abstract：Objective To observe the effect and mechanism of peroxisome proliferator-activated receptor α activator K877 on c-fos gene expression in human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein.Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro，stimulated with oxidized low density lipoprotein，and K877 was used for intervention. Reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the expression of c-fos gene.Results Compared with the control group，the expression of c-fos gene was increased in the oxidized low density lipoprotein group（P<0.05）.Compared with the oxidized low density lipoprotein group，the expression of c-fos gene was decreased in the K877 group（P<0.05）.Compared with the K877 group，the expression of K877 combined with poly-clinic acid c-fos gene was further decreased（P<0.05）.Conclusion Oxidized low density lipoprotein promotes the expression of c-fos gene in human umbilical vein endothelial cells.Peroxisome proliferator-activated receptor α activator K877 can inhibit the expression of c-fos gene and hemagglutinin-like oxidation.Low density lipoprotein receptor 1 is involved in this process.

Key words：Endothelial cells；c-fos；Oxidized low density lipoprotein；Peroxisome proliferator-activated receptor

氧化低密度脂蛋白在内皮细胞损伤中起重要作用，内皮细胞的损伤启动粥样硬化，诱导斑块的形成。内皮细胞损伤的机制复杂众多[1]，其中细胞增殖分化可引起血管内壁在形态结构稳定、代谢、生长、信号传递等方面出现紊乱，引起动脉粥样硬化事件的发生[2]，如急性冠脉综合征、脑卒中等，因此，探讨氧化低密度脂蛋白在内皮细胞损伤机制对动脉粥样硬化的防治具有重要的意义。本文选择人工培养人脐静脉内皮细胞，经氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）氧化处理，观察高选择性过氧化物酶体增生物激活受体α激活物（PPARα，K877）[3]对c-fos基因表达的影响及探讨血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（Lox-1）与该过程是否有关，进而探讨内皮细胞损伤的相关机制及K877在动脉粥样硬化中有利作用。

1材料和方法

1.1材料 本课题自2017年1月～10月在十堰市太和医院中心实验室完成。人脐静脉来自新生儿脐带，标本取自健康的剖宫产产妇；药品与试剂M199培养基、Ⅱ型胶原酶、0.25%胰酶-EDTA（美国Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青）、青霉素（齐鲁制药有限公司，批号：F7072308，规格：160万IU）、鏈霉素（华北制药股份有限公司，批号：170726，规格：100万IU）、多聚肌苷酸（上海远慕生物科技有限公司，批号：30918-54-8，规格：1.0 g）、Trizol试剂盒（美国Gibco公司），明胶（美国MP公司），内皮细胞生长因子和Lowry's试剂盒（美国Sigma公司）；兔抗人Ⅷ因子抗体（博奥森公司），过氧化物酶体增生物激活受体α激活物K877（上海皓元生物医药科技有限公司，批号E124537，规格10 mg），RT-PCR试剂盒（加拿大Fermentas公司）。主要仪器：二氧化碳培养箱（英国Cecil公司，型号18517C）、台式冷冻离心机（军事医学科学院实验仪器厂，型号TLL-D）、培养瓶（美国Corning公司，型号J00751）。

1.2氧化低密度脂蛋白的制备 分离低密度脂蛋白采用一次性密度梯度超速离心法。血浆来自十堰市中心血站血库。血浆于4 ℃、50000 r/min离心5 h。分离出的LDL在4 ℃的LDL透析36 h，无菌保存。用Lowry's法测定LDL的蛋白含量。把已氧化的LDL在无EDTA的PBS（0.01 mol/L，pH=7.4）中4 ℃透析36 h，然后加入含CuSO4 PBS液，使Cu2+的终浓度为5.00 μmol/L，37 ℃氧化18 h。氧化结束后置于含200.00 μmol/L EDTA 的PBS液中透析24 h，并于4 ℃避光保存。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定LDL和ox-LDL的纯度，硫代巴比妥酸反应法测定LDL和ox-LDL的丙二醛含量以确定其氧化修饰程度。

1.3人及静脉内皮细胞的培养及分组 无菌条件下挤出脐带血管中的血液，放入灭菌的含双抗的PBS瓶中，行细胞培养。取第4、5代亚汇合状态的HUVEC分组进行后续实验。含0.1% FBS M199组为空白对照组。①对照组：普通培养基；②ox-LDL组：培养基中加入终浓度50 μg/ml ox-LDL培养24 h；③K877组：0.2 μmol/L K877预先作用内皮细胞2 h，再加入终浓度为50 μg/ml ox-LDL培养24 h。④K877+多聚肌甘酸组：终浓度250 μg/ml多聚肌甘酸预先作用内皮细胞2 h，再加入终浓度0.2 μmol/L K877预先作用内皮细胞2 h，最后加入终浓度为50 μg/mL ox-LDL培养24 h。

1.4检测c-fos基因的表达 引物由上海生物工程有限公司合成，逆转录聚合酶连反应检测的c-fos mRNA表达，用Trizol试剂盒，提取细胞总RNA，核酸电泳鉴定未被降解。然后进行cDNA的PCR扩增。c-fos引物：上游5'-CAGACTACGAGGCGTCATCC-3'，下游5'-GACCGTGGGAATGAAGTTG-3'，擴增长172 bp。94 ℃预变性4 min。PCR反应条件：94 ℃变性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环。取扩增产物10 μl，电泳1.5 h，分析结果成像、条带密度扫描，以β-actin为内参照，测定各组的c-fos mRNA相对量。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0建立数据库统计分析数据，计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1 c-fosmRNA的检测 与对照组比较，ox-LDL组c-fos基因表达增加（P<0.05）；与ox-LDL组比较，K877组c-fos基因表达减少（P<0.05）；与K877组比较，K877组+多聚肌甘酸组c-fos基因表达进一步减少（P<0.05），见表1。

2.2人脐静脉内皮细胞的鉴定 显微镜下观察细胞形态、人第Ⅷ因子相关抗原的SP免疫组化证实培养的细胞为内皮细胞，见图1、图2。

3讨论

ox-LDL对内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化的早期环节，已有的研究证实，内皮功能损伤与氧化应激、炎症刺激、细胞凋亡、代谢紊乱等密切相关[4]；本研究体外培养内皮细胞，观察到ox-LDL可诱导人脐静脉内皮细胞凋亡基因c-fos基因表达，原癌基因c-fos基因，是生物体内一种非常重要的基因，对细胞生长、分化、代谢、形态的稳定性起到重要的调控作用[5]，是内皮细胞损伤的重要生物标志物[6]。本研究结果显示，c-fos基因在高浓度ox-LDL作用下表达明显增加，提示内皮细胞过度增值分化是血脂异常致动脉粥样硬化的机制之一，c-fos基因可能是动脉粥样硬化早期生物标志物。

LOX-1与ox-LDL的代谢密切相关，主要表达于血管内皮细胞，具有多种生物学效应，介导内皮损伤信号转导[7]。本实验利用LOX-1的抑制剂多聚肌苷酸，阻断LOX-1的介导作用，进一步观察到ox-LDL对内皮细胞c-fos基因mRNA表达下调作用进一步被抑制，提示LOX-1也参入了ox-LDL诱导内皮细胞c-fos基因表达的过程。

ox-LDL在内皮细胞损伤、动脉粥样硬化中扮演着重要的角色，尽管他汀类药物在临床上得到了广泛的应用，但仍有部分患者并未从中获益，因此，探讨新的药物治疗，对不能从他汀类药物获益的患者有着重要的意义，K877是一种人工合成的具有高活性和高选择性的过氧化物酶体增生物激活受体α（PPARα）的激活物，激活PPARα可以减轻炎症反应、改善内皮细胞的功能，在抗动脉硬化的过程中发挥着重要作用[8]。国外Ⅲ期临床研究显示[9]，K877显著降低TG和TC作用，在动物的药代动力学实验中也有很好的口服生物利用度以及低血浆清除率，K877组改善了肝脏酶，减少了对肾功能产生的不良反应。本研究显示，K877可抑制ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞c-fos基因表达，提示激活PPARα受体是抗动脉粥样硬化有效措施之一。

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收稿日期：2018-6-27；修回日期：2018-7-10

编辑/杨倩